编者：资源增量是实验动物科技生长的焦点使命，是实验动物对生命科学研究提供支持和效劳的基础和保 障 。自上世纪 80 年月以来，我国老一辈实验动物科学家苦心孤诣，在实验动物资源研发事情中取得的多项开立异效果 。
1988年《实验动物治理条例》宣布实验，在实验动物事情规范化、法制化治理，包管实验动物和动物实验的质量，推动我国科技生长和民生包管等方面施展了主要作用 。特殊是在实验动物资源标准化、新品种/品 系开发和动物模子创造方面，取得了令人瞩目的效果 。
为此，借“科技资讯”之窗，陆续推出我国实验动物专家在此领域所作的事情及取得的应用效果 。
实验用 SPF 明确猪和长白猪的标准化研究与应用远景
高彩霞 辛畅 陈洪岩
（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物手艺国家重点实验室，黑龙江省实验动物与较量医学重点实验室，哈尔滨，150069）
摘要:标准化 SPF 猪群是生命科学研究的主要支持条件之一，在畜牧兽医生产实践中也施展着主要作用 。 明确猪和长白猪是最普遍的主导瘦肉型商业品系，在实验动物方面的研究鲜有报道 。本文先容了 SPF 明确猪和长白猪基础群的引进，探讨了猪群的标准化研究和应用远景，其研究不但富厚了我国实验动物资源，也为畜禽 疫病防控手艺研发提供焦点支持 。
无特定病原体（Specific pathogen-free, SPF）猪是国际公认的标准化的、主要的高品级大型农用实验 动物，是生命科学研究、生物制品生产的主要实验质料和原质料，是畜禽疫病防控研究的焦点依赖，关于解决在动物疫病爆发、生长、撒播机制、致病机理研究以及防疫用生物制品研制中的科学问题和要害手艺，包管畜禽养殖业康健、可一连生长至关主要 。
1、实验用 SPF 明确猪和长白猪培育的配景
实验用小型猪已普遍用于生命科学、医药学、畜禽疫病、人兽共患疫病防控等研究，它是生物制品研发、 生产磨练和包管质量的实验动物，是生物检测的主要工具，是人类医学研究的主要模子，是异种器官移植的供体和高品质生物制品质料获取的主要泉源[1] 。欧、美等蓬勃国家对 SPF 小型猪的开发高度重视，建设有完整的 质量标准系统，周全的检测手艺系统，并且建设了严酷的模子构建及评价标准 。我国开发 SPF 小型猪群尚面临 重重难题，主要是由于我国现在尚无高质量的 SPF 小型猪基础群，仅有个体单位保有小规模的 SPF 猪群 。在畜禽疫病防控研究，生物制剂研发、生产等方面推广使用度较低，除获得 SPF 小型猪难题外，现有的部分种群小 型猪抗病性较强、质量均一性较差也是主要因素 。疫苗研发、临床试验、药物筛选、病毒熏染等研究现在主要使用农场或农村散养猪，动物遗传配景杂乱，疫病净化难度大，抗病性纷歧，实验效果的可靠性大大降低 。又 因我国实验强制免疫政策，故获得疫病防控研究用非免疫（无抗）实验猪也很是难题，严重滞后了畜禽疫病防控的研究历程 [2-3] 。因此，建设适合疫病防控研究的非免疫（无抗）实验猪，特殊是 SPF 猪种群很是主要 。
明确猪和长白猪是现在天下上使用最普遍的瘦肉型商业品系，具有生长速率快、滋生力高、顺应性强以及瘦肉率高等优良品质特征[4] 。我国从上世纪五六十年月引进明确猪和长白猪后，一直作为商品化肉用型猪来饲 养，占我国生猪饲养量的 60%以上 。因此，开发其作为疫病防控研究用 SPF 猪很是合适 。
开发 SPF 明确猪和长白猪，培育适合我国国情的 SPF 猪种质资源，同时建设饲育、治理和质量控制标准化手艺，填补 SPF 猪空缺，解决实验用猪瓶颈问题，实现优质种质资源共享使用，提升动物疫病研究水平，加速生命科学研究和生物制品工业结构的调解，推动行业和社会的前进，意义重大 。
2、实验用明确猪和长白猪的引进
2014 年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所从加拿大引进纯种 SPF 明确猪和长白猪共 100 头，种母猪各40头，种公猪各 10 头，拟对其举行实验动物标准化培育建设适合我国国情的实验用 SPF 猪种群 。猪群引进后先举行隔离检疫，对全群猪采血采样，经检疫部分检疫，引进猪无猪喘气病、猪胸膜性肺炎（1,2,5,7,12 型）、萎缩性鼻炎、猪痢疾、猪滋生与呼吸综合症、猪熏染性胃肠炎、猪盛行性腹泻、猪流感、伪狂犬、虱等动物疫病，抵达引进猪的要求 。然后将其饲养于屏障情形，生产情形和设施达标，切合国家标准（GB 14925-2010）划定 。猪群的饲料和饮水等切合相关标准和要求，从业职员取得实验动物从业职员上岗资格证，建设实验猪标准化生产设施规章制度和标准操作规程，取得了实验动物生产允许证（SCXK（黑）2015-004） 。
3、实验用 SPF 明确猪和长白猪的标准化研究
3.1 遗传学研究
3.1.1 群体遗传多样性
为了研究明确猪和长白猪的群体遗传多样性，接纳 19 对微卫星引物对该群体举行群体遗传学剖析 。效果发明 19 个微卫星位点在明确猪群中检测到 84 个等位基因，长白猪群中检测到 89 个等位基因 。明确猪的平均多态信息含量清静均杂合度划分为 0.5271 和 0.5877 ；长白猪的平均多态信息含量清静均杂合度划分为 0.5652和 0.6066 。由于 S0155，S0143，S0178，Sw857 和 Sw936 位点内等位基因巨细和含量差别显著（P=0.0151）可作为明确猪和长白猪品种判断的候选位点 。F-统计和迁徙率剖析效果批注，群体内的分解较小，遗传结构稳固[5] 。因此，引进的加系纯种明确猪和长白猪的遗传结构与海内部分纯种明确猪和长白猪相比更为稳固 。别的，制订了整体标准《实验动物 SPF 猪遗传质量控制》（T/CALAS 19-2017） 。
3.1.2 母系遗传结构
剖析实验用明确猪和长白猪的线粒体 DNA 控制区（D-loop 区）遗传多样性，展现其母系遗传结构，同时以我国地方品种巴马小型猪和融水小型猪为比照 。效果发明 107 个样本中共检测到 40 个多态位点，分为 13个单倍型，与地方品种相比，明确猪和长白猪单倍型数较少，划分含有 3 种和 2 种特有单倍型，只有 1 个共享单倍型 H4 。两猪群中各保存 1 个优势单倍型 。单倍型多样度（Hd）剖析，融水小型猪单倍型多样度最高（0.767），长白猪最低（0.429），明确猪和巴马小型猪划分为 0.566 和 0.503 。批注实验用明确猪和长白猪种群的单倍型数较少，各保存 1 个优势单倍型，遗传多样性低，具有清晰的母系遗传结构，有利于进一步的实验动物标准化以及遗传质量控制研究 。
3.2 微生物的净化
我国 SPF 猪群疫病净化难度较大，其主要缘故原由之一是我国尚未建设切合我国国情的 SPF 猪标准，已有的标准 GB/T 22914-2008《SPF猪病原的控制与监测》主要思量的是我国养猪业的现状，偏向于集约化生产，并未思量实验动物化需求，并且揭晓时间较早，有一些地方标准主要是针对我国实验用小型猪而制订 。因此关于SPF 明确猪和长白猪种群的建设，首先参照外洋蓬勃国家 SPF 猪的微生物监测，团结我国病原盛行情形以及现实饲养情形，制订了整体标准《实验动物 SPF 猪微生物学监测》（T/CALAS 33-2017）和《实验动物 SPF 猪寄生虫学监测》（T/CALAS34-2017），制订了黑龙江省地方标准《实验动物 猪寄生虫学品级及监测》（DB23/T2057.9-2017），划定扫除 9 种病毒病、8 种细菌病和 3 种寄生虫 。凭证制订的标准对加系明确猪和长白猪基础群举行了 4 次全群监测，确定猪群已净化了 14 种疫病，主要的病毒病均为阴性，微生物质量优良 。
3.3 生物学特征研究
为了剖析 SPF 明确猪和长白猪的生殖心理和血液心理生化特征，使用通例要领测定了猪群 10 项生殖心理指标、19 项血液心理和 18 项血液生化指标，统计剖析各指标在差别群体、差别年岁、差别性别间的差别 。效果发明 SPF 明确猪和长白猪生殖心理指标和血液大部分神理生化指标差别不显著（P>0.05），个体指标如血液心理指标 GRAN、HGB、RDW、PLT、PCT，血液生化指标 ALKP、CHOL、TBIL、BUN 在品种间、差别年岁以及差别性别之间差别显著（P<0.05），但其偏离正常值规模较小 。SPF明确猪和长白猪在生殖心理和血液心理生化等方面基本稳固，与其它实验用小型猪相比差别不大，为其标准化饲养、动物模子的构建以及关闭群猪群遗传质量的评价提供了主要的基础数据[6] 。
3.4 免疫遗传学研究
3.4.1 SPF 明确猪和长白猪 SLA 单倍型多样性的剖析
为了研究 SPF 明确猪和长白猪的 SLA 单倍型特征，对 15 头明确猪和 22 头长白猪扩增 SLA-1、SLA-2、SLA-3、DRB1、DQB1 和 DQA 基因，剖析其等位基因序列，发明 6 个基因共保存 68 个等位基因，其中 3 个为未确定等位基因，3 个 DQA 等位基由于新发明等位基因 。凭证获得的等位基因建设了 PCR-SSP SLA 分型要领，对 330 头明确和长白仔猪举行 SLA 分型，共获得 17 个 SLA I 类、11 个 II 类和 3 个重组 SLA 单倍型 。所有的等位基因和单倍型已获得 ISAG SLA 命名委员官方命名 。并使用 MHCcluster 要领剖析了 19 个常见 SLA I 类分子特异性团结肽段的功效性差别，发明这些分子从功效上显着地聚为 4 个分支，批注肽团结基序可分为 4 大类，对实验动物标准化及其选择，尤其是杂合子个体作为实验动物时做出了提醒[7-9] 。
3.4.2 体外试验剖析差别 SLA-1 分子团结疫病 CTL 表位的特异性
划分合成 5 个已判断的猪瘟病毒（CSFV）（1 个）和猪滋生与呼吸综合征病毒（PRRSV）（4 个）CTLs 表位引物，使用 SOE-PCR 手艺在体外构建表位-SLA-1 胞外区-β2m 复合体，使用原核表达系统举行表达，纯化和复性，用 ELISA 要领检测 SLA-1 分子与表位团结的特异性 。效果发明 SLA-1*13:01、SLA-1*11:10 和SLA-1*11:01:02 卵白可以特征团结差别的猪源病毒 CTL 表位，并且判断出 5 个已知 CTLs 表位的 MHC 限制性 。别的，与 5 个表位都团结的 SLA-1*13:01 分子 Asn151Val152 突变为不与表位团结的 SLA-1*04:01:01 分子响应位置的氨基酸后，SLA-1*13:01 突变等位分子与 5 个表位均不爆发团结，相反，SLA-1*04:01:01 分子第 151和 152 位氨基酸突变为 SLA-1*13:01 分子 Asn151Val152 后，突变分子与 5 个表位均爆发了差别水平的团结 。团结槽三维结构显示 Asn151Val152 影响 E 口袋巨细和性状，从而影响与表位多肽的团结 。因此牢靠组合的Asn151Val152 氨基酸可能是影响 CTL 表位特异性团结 SLA-1*13:01 和 SLA-1*04:01:01 分子的要害氨基酸 。这些研究可为差别 SLA 单倍型猪群对疫病的抗性和易感性研究提供依据[10] 。
3.5 猪用隔离器的开发
开发了新型猪用隔离器，在猪生涯仓与渗透物网络仓之间设有水平设置的漏缝地板 ；该渗透物网络仓的底部为中央向下突出的锥形，在底部的下端设有排污口 ；在猪生涯仓的顶部设有空气过滤器、采光窗和物品转达窗 ；在猪生涯仓的下部侧面设有大颗粒粪便转达窗 。在隔离器内部靠近底部的位置装置漏缝地板，在隔离器外侧装置专用的大颗粒粪便转达窗，其底边略高于漏缝地板 。这样的设计可以在除粪时将猪的大颗粪便使用隔离器内的铁锹从专用的传粪窗传出，小的粪便及尿液则从漏缝地板落下，经排污管倾轧，解决了猪粪便经常梗塞排污管的问题，也改善了猪的卫生情形，大大镌汰了冲水量，降低了粪尿混淆滋生细菌的危害，已获得了适用新型专利 。
4、实验用 SPF 明确猪和长白猪的应用远景
4.1 用于重大疫病防控研究
SPF 明确猪和长白猪，已净化了 14 种病原，且遗传分解较小，遗传结构稳固， 可大宗应用于重大动物疫病致病机理、免疫机制及防控手艺研究，如猪瘟、高致病性蓝耳病、口蹄疫等重大疫病病原学、病原遗传变异与分子进化、诊断与监测手艺以及新型疫苗研制等 � ；箍墒褂闷溆攀蒲芯坑跋炫嘤闹饕静〔≡乃拗饕Ψ肿�，为刷新特定 SPF 猪资源的培育提供修饰靶点，进而运用基因修饰手艺建设抗病性较强的转基因实验用猪新品种和品系 。标准化 SPF 明确猪和长白猪的培育将对包管我国养猪业康健生长与疫病有用防控提供强有力的手艺支持，也可加速多种严重危害畜牧业的烈性病研究，从而增强相关的疫病防控事情[11] 。
4.2 用于生物制品研发、生产和磨练研究
微生物质量优良、遗传结构稳固的 SPF 明确猪和长白猪的标准化培育对提高古板疫苗产品的产量和质量、研制新型高效疫苗、生长兽用疫苗工业、知足兽医生物制品和人用疫苗研发、生产与磨练中对大宗标准化实验用猪的需求有主要意义[12] 。同时可用作高品质生物制品质料获取的主要泉源，如提供及格的高品质 SPF 猪阴性血清，增进猪病相关的基础研究、检测要领的建设，也是动物源性生物医用质料的主要泉源 。
4.3 用作人类医学研究的主要模子
猪在剖解学、心理学、疾病爆发气理等方面与人相似，现在已被普遍运用于心血管病、糖尿病、皮肤烧伤、血液病等多方面研究，在生命科学研究领域中具有主要的应用价值，同时也在人用疫苗的研发和评价中同样施展着不可替换的作用[13] 。加系 SPF 明确猪和长白猪，生物学特征如生殖心理和血液心理生化方面基本稳固，部分血液心理生化指标与人相似，可以作为人类医学研究的替换模子，如使用 SPF 猪遗传配景清晰且遗传结构稳固的优势研究先天性遗传性疾病，提高研究效果的准确性和可靠性 。
4.4 用作异种器官移植的供体
由于猪是人类异种器官移植的主要泉源，可为人类开展异种器官移植和生物质料提供富足的供体质料[14-15] 。异种移植时，由于供体猪种属差别，受体对猪的器官会爆发强烈的免疫倾轧反应 。SLA是引起猪-人异种器官移植急性细胞性倾轧的遗传因素之一[16] 。以差别 SLA 单倍型猪为供体举行异种器官移植后，移植效果保存显着差别 。明确差别猪品种的 SLA 单倍型特征对猪-人异种器官移植 MHC 配型的研究具有主要的意义 。加系 SPF明确猪和长白猪已经举行了 SLA 单倍型特征剖析，发明了 62 个 SLA 等位基因，划分组成了 17 个 I 类和 11 个II 类单倍型，具有高度的多样性，具有潜在的器官移植价值 。
标准化SPF明确猪和长白猪的培育在生命科学、医疗卫生、畜牧兽医、新药研发与清静评价、食物清静等领域中具有十分主要的职位和作用 。它是主要的动物遗传资源，不但可以富厚实验动物资源，也可为畜牧业提供良种资源 。我国在 2017 年国家重点研发妄想重点专项和 2018 年国家自然基金中均设立和资助了SPF猪培育相关的项目，批注我国已经将 SPF 猪的培育列入了重点研究领域 � ？蛊渑嘤陀τ醚芯拷谛笄菀卟》揽亍⑿笄葜忠盗⒁臁⑵鞴僖浦病⒁窖Ｗ哟丛旌凸参郎：μ岱赖确矫媸┱怪卮蟮那绷� 。
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