编者：资源增量是实验动物科技生长的焦点使命，是实验动物对生命科学研究提供支持和效劳的基础和包管。自上世纪80年月以来，我国老一辈实验动物科学家苦心孤诣，在实验动物资源研发事情中取得了多项开立异效果。
1988年《实验动物治理条例》宣布实验，在实验动物事情规范化、法制化治理，包管实验动物和动物实验的质量，推动我国科技生长和民生包管等方面施展了主要作用。特殊是在实验动物资源标准化、新品种/品系开发和动物模子创造方面，取得了令人瞩目的效果。
为此，借“科技资讯”之窗，陆续推出我国实验动物专家在此领域所作的事情及取得的应用效果。
非人灵长类模式动物
非人灵长类动物为社群性动物，具有显着的社会品级关系和重大的行为运动，相关于常用的啮齿类实验动物，非人灵长类在心理、剖解、行为和生物医学特征上更靠近于人类，是医学和生命科学研究中的高级实验动物，在人类疾病防控的疫苗研制研发、人类脑功效与神经系统疾病研究中具有其他实验动物难以替换的作用。随着对人类医药和康健研究的深入，低等模式动物在一些领域已经不可知足研究的需要，迫切需要建设诸如猴等进化上与人类更靠近的动物模子。
一、非人灵长类模式动物构建手艺生长简史和面临的问题
哺乳动物转基因手艺依赖于辅助生殖和胚胎操作。小鼠上早在上个世纪80年月就已经建设基因原核注射的过表达转基因手艺和基于胚胎干细胞的基因敲出和敲入手艺。这不但仅是由于小鼠是最常用的实验动物，早在上个世纪初就作育了大宗遗传配景一致的近交系，还由于小鼠具有多胎生殖、性成熟和滋生周期短等自然优势。而最为普遍使用的非人灵长类实验动物食蟹猴和恒河猴不但遗传配景重大，且为有月经周期的单胎生殖，即每个月经周期排卵1-2枚，而其性成熟时间更是长达4年以上，加上近半年的有身期（约160-170天），这样整个滋生周期要在5年以上，同时，现在也没有获得可生殖系传代的胚胎干细胞。在胚胎资源有限和低滋生能力这一自然劣势的限制下，非人灵长类模式动物构建手艺希望相对缓慢。2001年，美国俄勒冈康健科学大学的Schatten教授团队使用高滴度的逆转录病毒载体乐成将外源基因导入恒河猴的胚胎，获得了天下上首只转基因灵长类动物ANDi（意指inserted DNA），虽然在其获得的3只出生个体中仅有1只检测到了外源基因GFP的整合和嵌合表达，但这一开创性的事情标记着转基因非人灵长类手艺的降生。同年7月，Wolfgang 等同样使用慢病毒载体转染恒河猴囊胚期胚胎后移植，也获得了在胎盘组织中整合了外源eGFP的转基因恒河猴。这两个开创性的事情说明转基因非人灵长类手艺实现了从理想到现实的转变。他们都选择绿色荧光卵白作为转入的目的基因，其主要目的照旧用来探讨转基因非人灵长类手艺的可行性。在这些事情揭晓7年后，美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学Anthony Chan团队于2008年报道使用慢病毒转染手艺获得了天下上首批亨延顿舞蹈症转基因恒河猴。亨廷顿疾病是一种显性的神经性病变疾病，主要是由于人亨廷顿基因 (HTT) 第一个外显子中CAG重复扩增，导致表达的亨廷顿卵白中含有多聚谷氨酰胺，从而引发运动性能损伤、认知功效退化和精神失调等一系列病症，患者发病10?15年后就会殒命。虽然也有亨廷顿疾病啮齿类转基因动物模子，但这些模子都不可很好地模拟亨廷顿疾病在人体的表型特征。在亨廷顿转基因恒河猴的事情中，作者把人HTT基因的第 一个外显子上后面链接84个CAG重复序列，并把这段重组序列包装到慢病毒载体中，获得高滴度的慢病毒颗 粒 (滴度>109PFU/mL)。通过卵母细胞透明带下注射把病毒粒子注射到恒河猴MI期卵母细胞的卵周隙。之后，再通过单精注射让卵母细胞受精和胚胎移植，乐成获得转基因恒河猴。剖析效果显示转基因猴不但表达了外源基因， 并且泛起了神经纤维网群集、核内含物，同时，体现出肌无力和舞蹈症等亨廷顿舞蹈症病人的典范标记表型。作为第一个非人灵长类疾病动物模子，亨廷顿疾病转基因恒河猴模子的意义之大是不言而喻的。该模子可以让人们更好、更深入地相识亨廷顿疾病，研究其发病机制和致病机理，从而研发出相对应的治疗计划和药物。同时，该模子的建设也证实晰构建其他非人灵长类疾病模子的可行性。厥后，2009年日本科学家Sasaki等使用绒猴性成熟时间相对较短的特征，通过慢病毒载体转染手艺乐成获得了可生殖系转达的GFP转基因绒猴。我国虽然在非人灵长类辅助生殖和转基因手艺上起步较晚，2008 年华东师范大学报道了海内首例试管食蟹，这足足比美国晚了24年（第一只试管猴出生于1983年），但经由近10年的生长已经逐渐遇上并凌驾了美国、日本等国，处于领跑职位。
在过表达转基因猴构建事情上，2010 年中国科学院昆明动物研究所报道了海内首例转基因猴；2016年中科院神经科学研究所非人灵长类研究平台孙强团队与仇子龙组报道了用慢病毒转染要领将人的自闭症相关致病基因MeCP2乐成转入食蟹猴个体获得了多只有类似人类自闭症表型的转基因食蟹猴，并使用灵长类研究平台首创的猴精巢异种移植手艺提早获得了转基因猴的F1代。通过慢病毒载体介导获得的非人灵长类转基因手艺只能完成外源基因的过表达操作，致其应用规模有限。由于在非人灵长类上还未建设可生殖系整合的猴胚胎干细胞系，因此还不可像通过胚胎干细胞基因打靶操作获得基因敲除小鼠模子那样来构建基因敲除猴模子。随着人工核酸酶手艺的泛起，尤其是高效的CRISPR-Cas9核酶的泛起，使得我们可以跨过非人灵长类无胚胎干细胞用于举行同源重组基因打靶的这一手艺障碍，直接通过早期猴胚胎注射用于靶向特定基因的分子核酶对靶基因举行编辑，进而获得响应靶基因突变的猴模子，这使得非人灵长类基因编辑成为了可能。
2014年，来自昆明理工大学和中国科学院神经科学研究所的两个团队划分通过受精卵注射靶向食蟹猴Mecp2基因的TALEN质粒和mRNA获得了Mecp2 基因突变食蟹猴。 随后南京大学、南京医科大学和昆明理工大学团结报道了使用CRISPR/Cas9手艺获得了基因编辑的食蟹猴。该事情通过将针对Ppar-γ、Rag1 和Nr0b1三个基因的5条sgRNA和Cas9 mRNA混淆注入食蟹猴受精卵的卵胞质并将注射后的胚胎移植到代孕受体，最后获得了Ppar-γ 和 Rag1基因编辑食蟹猴。之后，来自中国的多个实验室报道了多种差别的基因编辑猴，而日本科学家使用ZFN和TALEN乐成获得了IL2RG基因编辑绒猴。至此，过表达和基因编辑这两项主要的模式动物构建手艺在非人灵长类的主要物种恒河猴、食蟹猴和绒猴上都获得了乐成。
二、怎样实现非人灵长类模式动物构建的标准化
然而，慢病毒载体介导外源转基因通常是以多位点多拷贝整合的方法整合到宿主基因组中，而通过基因编辑手艺构建的首建猴个体大都为嵌合体突变，这导致我们很难获得基因型一致的转基因或基因编辑首建个体。而这种基因型的多变，也使得我们很难准确地将转基因或目的基因突变和潜在表型对应起来。因此，使用这些要领获得的首建猴并不可称之为标准的动物模子。
为了有用解决这一问题，建设基于体细胞核移植的非人灵长类模式动物构建手艺成为了一定。这是由于在核移植前，可对体细胞举行转基因或（和）基因编辑操作以获得含有目的基因修饰的细胞，在将基因修饰后的细胞作为供体核举行核移植，就可获得一批遗传配景一致的基因修饰克隆动物。然而，这一手艺建设的条件是首先攻克非人灵长类的体细胞核移植手艺，并获得康健的克隆猴个体。
自1996年，首个体细胞核移植哺乳动物多莉羊出生以来，使用该手艺已经获得了包括马、牛、羊、猪和骆驼等在内大型家畜，也获得了包括小鼠、大鼠、兔、猫和狗在内的多种实验动物。非人灵长类体细胞核移植的研究事情从2002年就最先有报道，只管有海内外多家机构一直实验，可是这些研究最终都没有乐成获得体细胞核移植泉源的克隆猴。2003年，美国匹兹堡医学院Schatten教授操作了700枚猴卵，并移植16只受体，没能获得一只有身受体。2007年美国俄勒冈国家灵长类研究中心教授Mitalipov接受采访时指出，他前后共使用了15000枚卵母细胞用于克隆猴实验，但获得的最好效果也仅仅是有身81天后的流产组织。海内外多家顶级实验室在此领域一连受挫，使得科学家们逐渐失去了对该领域继续攻关的信心。之前的体细胞克隆猴研究之以是一直没有获得乐成，主要有两方面的缘故原由。一是非人灵长类体细胞核移植手艺要求高，无论是卵母细胞去核照旧体细胞的注入，灵长类核移植手艺操作难度远高于现在已经乐成的其他哺乳动物。二是，克隆胚胎发育效率低，灵长类体细胞克隆胚胎的发育效率远远低于其他哺乳动物。
为了建设非人灵长类体细胞核移植手艺并获得康健存活的克隆猴，中科院神经科学研究所非人灵长类研究（苏州）平台孙强团队经由多年积累，熟练的掌握并刷新了猴体细胞核移植的一系列显微操作技巧，同时针对多种能够提升哺乳动物体细胞核移植效率的要领，举行了逐一验证并筛选获得了可以显着提升猴体细胞核移植胚胎发育效率的要领，在团结使用组卵白（H3K9me3）去甲基化酶Kdm4d和去乙�；敢种萍罷SA的条件下，乐成将食蟹猴体细胞克隆胚胎的体外囊胚发育率从13.8%提升到了44.7%，同时囊胚的质量也有了显著的提高。在此基础上，以胎猴成纤维细胞为供体细胞，举行了克隆猴胚胎构建和移植，乐成获得了天下上首批康健存活 的体细胞克隆猴“中中”和“华华”。此项手艺突破为非人灵长类模式动物构建提供了主要的手艺支持，被《Cell》 杂志主编Emilie Marcus赞美为“生物手艺领域近20年来的里程碑事务”。
体细胞克隆手艺的建设关于开展非人灵长类基因编辑动物模子研究至关主要。首先，在体细胞上可实现重大的遗传操作；其次，通过严酷筛选可去除脱靶；最后，可在一个孕周期（160天）内获得遗传配景和基因型都一致遗传修饰猴，这也有用战胜了非人灵长类实验动物无遗传配景一致的近交系和传代时间过长的问题，使得非人灵长类遗传修饰动物称为真正意义上可以普遍应用的标准化的模式动物。
三、非人灵长类模式动物的应用远景
针对特定遗传相关疾病的转基因动物模子可以让科学家更好的明确疾病爆发生长的历程和机制。如在神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病和帕金森病的动物模子构建中，由于啮齿类动物在认知和行为上与灵长类的重大差别，使其在病理学与行为学特征的模拟以及药物疗效评价等方面都保存着无法填补的缺陷，这也在一定水平上延缓了神经退行性疾病的研究和药物研发历程。借助于非人灵长类动物模子来研究神经系统疾病有望在较洪流平上填补这些缺陷。在生殖与康健领域，非人灵长类中的食蟹猴和恒河猴都是有月经周期的实验动物，且其平均周期也是28天，在月经周期内的生殖相关调控激素如促卵泡素、促黄体天生素、雌二醇和孕激素等的表达时相和转变纪律与人类高度相似，因此是研究生殖内渗透调控的最理想实验动物模子。别的，恒河猴和食蟹猴都有较长的青春期，也是用于研究青春期启动和调控机制的理想动物模子。
随着免疫疗法在肿瘤患者的治疗中爆发了很是好的疗效，陪同而来的免疫因子风暴和脑水肿等副作用也成为不可回避的问题，而小鼠模子很难模拟这些病理历程，今年头在cancer discovery上的一篇报道，用恒河猴模子乐成模拟了CAR-T处置惩罚后的免疫因子风暴和脑水肿症状，因此可以预见，在不就的未来非人灵长类模式动物将在这个领域也施展主要作用。别的诸如HIV，Ebola，Zika等熏染性疾病的防控及疫苗研发也离不开非人灵长类模式动物，类似糖尿病、高血压等慢性疾病，发病时间长，也同样需要有较长寿命的非人灵长类动物模子。而通过团结基因编辑和体细胞核移植手艺构建的标准化的非人灵长类模式动物，必将在这些研究领域施展主要做成，从而更好地增进人类康健事业生长。
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