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摘要：近年来 ，斑马鱼已成为心血管研究的强有力的脊椎动物模子。它的优点包括易于遗传操作、透明、体积小、本钱低 ，以及在发育早期无活跃循环的情形下生涯的能力。对整个基因组举行测序 ，并用人类基因组识别正位基因 ，使得通过遗传途径诱导临床相关的心血管缺陷成为可能。关于这些疾病模子 ，需要以可靠的方法评估心脏功效和受滋扰的血流动力学 ，以展现诱导缺陷的机械力学生物学。这项事情需要准确测定发育中心脏内的血流模式和血流动力学应力（即壁剪切应力和压力）水平。古板的要领是使用延时的明视野显微镜来跟踪细胞和组织的运动 ，但在最近的研究中 ，快速的光片荧鲜明微镜被用于这一目的。将更重大的手艺如粒子图像测速和盘算流体动力学模子相结适用于血流动力学剖析 ，有助于斑马鱼的研究。我们讨论了斑马鱼胚胎心脏功效和血流动力学剖析的最新希望 ，并总结了我们对斑马鱼心血管系统动力学剖析的未来展望。
简介：小鼠是已建设的哺乳动物心血管研究模子。敲除小鼠模子使研究许多先天性心脏缺陷（CHD）类型成为可能。胚胎鸡是一种常用的脊椎动物模子 ，具有类似于人的心脏结构的优点 ，具有四腔/四瓣结构 ，能够举行临床相关的手术操作。胚胎斑马鱼最近泛起在心血管研究中 ，用于高通量研究。只管斑马鱼心脏与人类心脏差别 ，只是系统循环 ，但两者的心脏结构和心理学是相似的。斑马鱼胚胎的奇异特征使其对心血管研究特殊有吸引力。例如 ，有一些适用的遗传滋扰要领 ，如吗啡寡聚核苷酸注射 ，以诱导斑马鱼心脏缺陷。这些胚胎是透明的 ，可以在心脏发育历程中无创成像。在体内 ，心腔和血管以及血流可以很容易地被视察到。在发育早期 ，斑马鱼胚胎不依赖于循环系统 ，由于被动扩散足以供氧。因此 ，具有严重心脏缺陷的胚胎能够在早期发育中存活 ，通过这种要领 ，我们研究了无血流情形下心脏瓣膜的发育情形 ，这些研究证实晰血流动力学对心脏瓣膜发育的主要影响。随着正向和反向遗传学要领的前进 ，现在有可能在斑马鱼胚胎中诱导种种临床相关的心脏缺陷。在这些动物模子中 ，需要对血流动力学举行剖析 ，以研究诱导缺陷的机械生物学机制。关于定性和定量的血流动力学剖析 ，有多种显微成像和盘算建模要领。这些剖析包括确定流型、丈量流速、盘算心功效参数和盘算血流动力学应力水平。
斑马鱼心脏发育：在脊椎动物胚胎中形成并最先运作的第一个器官是心脏。与双心室哺乳动物心脏差别 ，成年斑马鱼心脏由一个心室、一个心房、一个房室（AV）瓣膜和一个流出瓣膜组成。脊椎动物之间的遗传途径是守旧的 ，斑马鱼的心脏发育历程与其他脊椎动物相似。最早于前外侧板中胚层受精后5小时（hpf）的心前细胞最先 ，并继续形成原肠 ，再形成外胚层、内胚层和中胚层。原肠形成在10 hpf时完成 ，随后在16 hpf时胚胎中线处的双侧心脏融合。这就形成了一个心锥 ，然后向前延伸 ，酿成一个线性的心管。线性心导管的外层由缩短肌细胞组成 ，而内层由心内膜细胞组成。这两层由一层无细胞的细胞外基质层（称为心冻）离隔。在其形成后 ，24 hpf时线性心导管最先有节奏地蠕动缩短。人类的第一次心跳最先于3周 ，小鼠的第一次心跳最先于（e是胚胎发育日）e8.5 ，鸡的第一次心跳最先于（hh是鸡发育期）hh10。随后阶段斑马鱼胚胎的缩短水平可通过高速延时视频显微镜举行量化 ，以确定心室部分缩短 ，这是舒张和缩短时心室尺寸的较量。纵然在这个阶段没有瓣膜保存 ，血液仍以250μm/sec的峰值速率泵出 ，没有显着的回流。不久后 ，管腔最先开放 ，每博输出量和心跳迅速上升。在28 hpf时 ，心跳正常 ，频率为2.6 Hz。心脏管在33 hpf处呈S形向左转 ，心室移到心房右侧。在36 hpf时 ，泵送机制从缓慢的蠕动波转变为一连的心室缩短 ，提醒心脏传导系统的最先。受精后2天 ，心室室膨胀 ，内外弯曲显着。在此阶段 ，心肌细胞最先从心室壁分层 ，最先形成小梁 ，到72 hpf时心室有显着的小梁脊。小梁心肌随着心肌壁的显著重塑 ，以及致密心肌的增殖和传导系统的成熟而向心室腔扩张。遗传学筛选研究展现了斑马鱼这些早期事务的分子调控。与NKx2.5相关的GATA因子通过限制Wnt信号来控制心肌细胞祖细胞的迁徙和心脏的调理。Hand2在心脏分解和形态爆发中起作用 ，而Nkx2.5维持了心脏室的特征。最近 ，心脏缩短和由此爆发的液体实力被证实能够激活Notch信号来调理斑马鱼的心脏小梁。由小叶组成的心脏瓣膜确保斑马鱼单向血流。房室之间的房室管内有一个瓣膜 ，心室和球动脉之间的流出道内有一个瓣膜。房室瓣膜发育始于心肌中BMP4、TBX2b和VCANA的表达 ，以及37 hpf时Notch1b、Has2和神经调理卵白的心内膜表达。血流动力学是斑马鱼AV瓣膜发育的主要机械刺激。例如 ，KLF2A的表达依赖于反向流动的保存 ，而剪切应力控制着AV管中MIR-21的差别表达。在40 hpf时 ，心内膜垫最先转变为原始瓣叶。心内膜垫重塑为原始瓣叶 ，以避免76 hpf时完全逆行。此时通过心内膜垫的血流速率约为3.0毫米/秒 ，最大壁面剪应力（wss）为70dynes/平方厘米。心内膜垫的形成爆发在人类4.5周、小鼠e12周和鸡hh24周。在流出血管中 ，动脉球由一层厚的外层平滑肌细胞和一层薄的内层内皮细胞组成。这个小腔体是有弹性的 ，可以包管高压的坚持 ，避免自动脉回流。与三叶哺乳动物自动脉瓣相比 ，流出瓣只有两个瓣叶。斑马鱼心脏的流量可以通过简朴的追踪单个红细胞来丈量�；蛘� ，为了举行更详细的流量剖析 ，数字粒子图像测速（DPIV）可以通过一连帧之间的粒子位置相关性（在大大都情形下为红细胞荧光）天生空间流量图。这两种手艺都需要至少每秒150�。╢ps）的快速图像收罗。红细胞或血浆应荧光标记以增强比照度。
斑马鱼的遗传途径：只管胚胎鸡在外科/机械滋扰研究中被普遍应用 ，斑马鱼胚胎却适合于遗传滋扰。已知斑马鱼基因组序列 ，乐成地将正向/反向遗传要领应用于斑马鱼胚胎 ，以确定研究特定基因功效的分子途径。正向遗传学是决议一个有机体特定表型的遗传基础。另一方面 ，逆向遗传学是有选择地使用一个先前确定的基因 ，并剖析这种使用对生物体的影响。关于斑马鱼 ，通过辐射或化学处置惩罚乐成地诱导了基于正向遗传学的随机突变 ，并为杂交子女爆发了稳固的系。用这种要领爆发了数百个心血管发育异常的突变体。举例来说 ，通过正向遗传学筛选确定了导致瓣膜缺陷和自动脉缩窄的几个突变。正向遗传学的另一个例子是双突变系casper。这种突变体没有玄色素细胞和虹膜细胞 ，这使得它在整个生掷中都是透明的 ，能够举行无创成像。斑马鱼胚胎也可以使用几种反向遗传手艺选择性地抑制基因功效。最常用的手艺是将反义吗啉寡核苷酸（mos）注入受精卵。mos可以通过靶向转录起始位点或靶向剪接毗连并诱导异常剪接来抑制翻译。有用阻止靶基因的卵白质合成3-5天。由于在斑马鱼中易于使用 ，mos使基因功效的剖析得以普遍应用。很快就发明一些mos事情得很好 ，并且有许多mos表型有用地重演突变表型 ，而没有任何主要副作用。然而 ，mos可以诱导p53依赖性细胞凋亡和基因表达中的非靶向细胞特异性效应 ，这可能影响表型剖析。在大宗的基因敲除系中 ，在响应的突变体中 ，险些80%的Mo变形体表型没有被视察到 ，这导致人们质疑Mo在斑马鱼研究中的普遍应用。有人建议不应过量注射mos以限制靶向效应 ，必需爆发稳固的突变体并对其举行适当的表征 ，以验证mo变形剂的表型。斑马鱼最近引进了两种反向遗传学的替换手艺：TALENs和CRISPR/CAS9。这些手艺影响基因组DNA而不是RNA转录。因此 ，它们的分子效应可以在单胚胎水平上确定 ，以获得明确的表型/基因型相关性。这些手艺的非目的效应可以忽略不计。这些基因要领被用来在斑马鱼胚胎中爆发人类心血管疾病 ，以展现分子机制。有两种常见的形式：扩张型心肌病和肥厚型心肌病。对心肌病斑马鱼突变体的正向遗传筛选显示 ，titin、层粘连卵白α4和整合素毗连激酶的突变可导致模拟人类临床条件的心力衰竭。在一项反向遗传研究中 ，在判断了DCM患者的Eya4突变后 ，斑马鱼的Eya4基因通过吗啡寡聚核苷酸注射被敲除。由此爆发的表型具有心肌病 ，批注在这种情形下Eya4突变的作用。腾博会官网研究小组在肥厚型心肌病患者中发明了肌球卵白团结卵白C的几个突变 ，并通过吗啡寡聚核苷酸注射对斑马鱼模子中的这些突变举行了归纳综合。心脏功效剖析和血流动力学评估在这些和类似的动物缺陷模子中很主要。下面 ，我们将诠释这些斑马鱼胚胎的剖析手艺。
明视野延时图像序列的心脏功效剖析：在斑马鱼发育的早期阶段（3-4 dpf） ，胚胎是透明的 ，内部器官包括心脏和血液循环都有优异的可视性。因此 ，在这一阶段 ，视频明视野显微镜可用于心脏功效和形态的定量剖析。该要领是基于纪录二维（2D）图像序列以进一步举行心血管剖析。动物处于侧位 ，整个心脏周期心田室清晰可见。在此设置中 ，中庭不可见。使用自动视频边沿检测系统可以丈量心室功效的心肌壁。120-fps视频捕获速率足以知足此应用。缩短壁速率水平在2 dpf时约为200μm/sec ，在6 dpf时约为275μm/sec。心室壁运动也可以用类似于M型超声心动图的要领举行现实剖析。这里的目的是在整个心脏周期中跟踪心室壁位置的一连转变。通过首先确定感兴趣的线性区域来实现。这个区域要么是心室的短轴 ，要么是心室的长轴。关于M模式图像 ，沿这条线的强度值是Y轴 ，视频的每一帧在X轴中体现。这样 ，心室短轴和长轴直径的转变可以在整个心脏循环中丈量。M型剖析可以跟踪心肌壁厚和心室直径。舒张和缩短的短轴直径体现为dd和ds ，心肌厚度体现为mtd和mts。图像以250 fps的速率捕获 ，以获得优异的时间区分率。丈量血流速率以量化斑马鱼胚胎的心血管功效。这可以通过简朴地跟踪胚胎体内红细胞（RBC）的运动来实现 ，红细胞由于透明的皮肤很容易被识别出来�？梢耘趟愫煜赴硕募铀佟⒓跛俸头逯邓俾示傩衅饰�。红细胞在两条通过身体的主血管中的运动 ，在自动脉背侧和主静脉中 ，可以成像。
通过光片荧鲜明微镜举行三维实时成像：斑马鱼胚胎心脏的高区分率成像要求很高 ，由于其心率为2-4赫兹 ，相对较大的尺寸约为250μm。因此 ，斑马鱼心血管系统的体内功效和结组成像需要先进的显微镜 ，该显微镜可以纪录高时间和空间R值的光学切片。古板的共焦激光扫描荧鲜明微镜（CLSM）是基于物体的点扫描。穿透深度也相对较低；因此 ，捕获跳动的斑马鱼胚胎心脏是很难题的 ，尤其是关于较老的胚胎。光片荧鲜明微镜（LSFM）于2004年推出 ，以消除CLSM的局限性。这种手艺被称为选择性平面照显着微镜（SPIM）。其事情原理是使用薄激光片从侧面照射荧光标记的样品,仅在检测目的的焦平面引发荧光 ，同时纪录发射光.LSFM中的检测系统包括CCD/SCMOS摄像机 ，而不是像CLSM中那样的扫描光电倍增管探测器。因此 ，LSFM提供了几个主要的优点 ，包括提高收罗速率、高信噪比、低光漂白和大穿透深度。别的 ，在大大都应用中 ，样品被安排在一个专用的笔直支架（透明注射器或毛细管）中 ，并浸入一个充满介质的成像室中。将样品嵌入低浓度琼脂糖柱中 ，与古板的玻璃载玻片相比 ，低浓度琼脂糖柱对活的生物样品来说压力更小。笔直装置还可以在稳固形的情形下旋转细密样品 ，并利便360°成像。因此 ，LSFM成为斑马鱼研究的新标准成像方法 ，由于它能够在心理成像介质中实现快速和高区分率的动态成像。LSFM显著增强了斑马鱼胚胎的心功效剖析。心脏内的特定区域现在可以在体内高区分率成像。然而 ，为了对心脏举行完整和准确的功效剖析 ，需要对三维重修的心脏跳动图像举行三维剖析。心脏在所有维度上一连快速的运动 ，使得捕获这样高区分率的图像变得很是难题。一种解决步伐是像默然的心脏模子那样抑制心脏。然而 ，该模子不适用于研究心脏发育历程中的血流动力学和心脏缩短。另一种要领是使用前瞻性门控手艺获得静止的3D心脏。留神脏继续跳动时 ，它会在成像物镜的焦平面上缓慢移动。对这些图像举行三维重修 ，以在这个特定阶段天生心脏模子。不可用这种要领研究心跳的动力学。心脏跳动的动力学只能通过4D成像（3d+时间）举行周全剖析 ，这需要非�？焖俚耐枷袷章藓蜕疃却┩�。收罗后同步手艺的前进使得在4D中捕获斑马鱼胚胎心脏跳动的动态成为可能。?在这项手艺中 ，心脏组织的动态运动是通过对图像叠加的回首性时间配准来重修的。在整个心脏深度的一连光学截面上 ，纪录下跳动的心脏的短片。然后 ，对一连z平面的图像序枚举行回首性挂号 ，以制作心脏跳动的4D影片。心包细胞、心肌细胞和红细胞可以被荧光染色 ，以70–85 fps的速率录制的3D影戏可以用于制作4D影戏 ，实现详细和动态的心脏功效剖析。最近 ，双光子引发与LSFM的集成导致穿透深度的增强和光板厚度的保存 ，从而实现了高收罗速率（>70 fps）和低光损伤。为进一步提高扫描速率 ，已开发出新的要领。一种是多色LSFM。实现混淆波长引发 ，实现快速多色双光子成像。通过这种要领 ，划分对CFP、GFP和DSRED标记的心包、心肌和红细胞举行了模拟成像�？焖偈奔湫蛄型枷褚悦棵�85帧的速率收罗 ，然后用于天生心脏周期运动的4D影戏。与单色LSFM相比 ，该手艺没有爆发特另外光损伤。同时对心肌和红细胞成像可改善动态剖析。最后 ，图像收罗手艺的前进使4D影戏能够直接录制心脏跳动。光片显微镜现在可以纪录心肌壁和红细胞的动态运动；这一希望导致了先进手艺的应用 ，如粒子图像测速和盘算建模 ，斑马鱼心血管血流动力学剖析。
基于数字粒子图像测速（DPIV）的剪应力剖析：WSS是心血管系统中作用于血管壁和瓣叶外貌的摩擦力。它是剪切速率（与血管半径相关的速率导数）和血液动态粘度（流体粘度是其抗应力逐渐变形能力的一种怀抱）的产品。定量和定性剖析心血管系统中的WSS是主要的 ，由于它的巨细和偏向都被以为有助于心脏爆发。有主要证据批注 ，心血管内皮细胞上的WSS可显著影响血管和瓣膜的发育 ，以及成人有机体血管和瓣膜疾病的发病机制。具有差别流体力学特征（即稳固与不稳固、层流与湍流、顺行与振荡）的流动显示出对内皮细胞中特定基因表达途径的差别调理。因此 ，准确测定剪切应力模式和剪切应力水平关于心血管疾病的临床和体内研究具有主要意义。由于WSS与容器壁的轴向速率梯度成正比 ，因此应确定该位置的速率梯度来盘算WSS。然而 ，由于以下几个缘故原由 ，这不是一项容易的使命：重大的几何结构、不稳固的脉冲盛行为、移动的界线（即血管壁和瓣膜传单）和血液的非牛顿行为（血液粘度随剪切速率的转变、剪切减薄特征）。因此 ，关于WSS盘算 ，通常接纳简化假设 ，如理想几何、稳固流、简朴抛物线速率剖面、牛顿行为等 ，但这些都会导致不可靠的效果。DPIV已成为体内研究确定心血管系统中速率向量和WSS水平的有力工具。关于像斑马鱼心血管流这样的小几何体 ，DPIV需要对流场举行微观剖析。在这里 ，示踪粒子的直径很是主要 ，因此这些颗粒应足够大 ，能够单独识别 ，同时又足够小 ，能够追随局部流动。关于斑马鱼血流量的DPIV ，可以跟踪红细胞或注射珠。在Hove等人的开创性研究中 ，通过追踪红细胞来测定速率和WSS水平。
通过盘算流体动力学（CFD）举行血流动力学剖析：CFD模子在心血管研究中很是有利于研究重大的流体行为 ，实验丈量只能提供有限的信息。CFD模子也被用于体内研究 ，目的是研究发育中心脏的血流动力学。为此 ，胚胎雏鸡模子获得了普遍的应用。斑马鱼是另一种常用于心血管研究的动物模子。以前的研究批注 ，与其他动物系统相似 ，机械信号有助于斑马鱼心脏的发育。更详细地说 ，流体剪切应力和跨壁压力通过触发内皮细胞内的机械生物学机制来影响血管、腔和瓣膜的形态形成。通过发育中的心脏的血流受到滋扰 ，导致心脏发育改变 ，与人类冠心病相似。然而 ，有趣的是 ，关于斑马鱼模子的详细血流动力学研究 ，现在还缺乏CFD研究。在一项研究中 ，针对一个简化的心脏几何结构（近似于4.5 dpf斑马鱼心脏）开发了一个二维CFD模子。模子是一个线性通道 ，两个交织的心室从通道的对侧凸出 ，代表心房和心室。心内膜垫保存于流入道、AV管和流出道的背侧和腹侧。?接纳两种差别的要领举行血流模拟：第一种要领是通过刚性几何体在入口界线界说速率入口条件。在第二种要领中 ，心房和心室被界说为弹性子料 ，缩短的心房强制血流 ，缩短的心房弹性地舒展心室。通过求解控制流体流动方程 ，获得了作用于壁面和心内膜垫上的速率流线图和WSS值。对流线型的剖析批注 ，应思量移动界线以准确捕获流型。在刚性模子中 ，室壁最大法向应力为0.02 dynes/cm2 ，心内膜垫最大WSS为2 dynes/cm2。差别心内膜垫高度的模拟显示 ，这些垫的发育显著影响心脏内的WSS漫衍和巨细 ，以及室壁压力水平。最高的WSS位于缓冲垫上 ，随着高度的增添 ，WSS也会增添。由于狭窄的房室通道具有更高的流动阻力 ，随着垫层高度的增添 ，室壁上的法向压力也显著增添。在随后的研究中 ，将斑马鱼血流动力学界线建模要领应用于基于真实几何的CFD模子。接纳转基因斑马鱼胚胎 ，其中含有绿色荧光卵白标记的内皮/心内膜细胞和GATA1标记的红细胞。GFP标记可以跟踪管腔壁的界线 ，而GATA1标记可以跟踪血流（通过DPIV） ，因此可以丈量血流速率。斑马鱼胚胎在20-30 hpf到110-120 hpf阶段被纳入研究。使用荧鲜明微镜网络20 fps时胚胎心脏的二维图像。在每幅图像中 ，通过追踪荧光内皮细胞来确定管腔界线。建设了一种适用的要领来预计斑马鱼心脏中的WSS水平。该要领将活体共焦成像与CFD相团结 ，并基于从心壁动力学（而不是直接从红细胞运动）估算WSS水平。本研究使用48-hpf斑马鱼胚胎。在120 fps下对GATA1-DSRED标记的RBC举行实时成像 ，以天生4D心脏视图。在这个二维几何体上 ，界说了流体动力中心线 ，为心脏剖解提供了一维参数化。这些事情批注晰盘算流体动力学在斑马鱼血流动力学剖析中的主要性 ，但为了更好地明确心脏发育的机理 ，还需要做更多的事情。盘算机模子需要在3D中开发 ，并且必需团结壁动力学和流体动力学（流体-结构相互作用要领）举行准确剖析。
结论：在已往的几十年里 ，斑马鱼模子已经生长成为一个很是强盛的模子来研究心脏发育。正向和反向遗传滋扰手艺的前进使得在这些动物身上诱导人类心血管缺陷成为可能。心血管动力学已经在这些疾病模子中举行了研究 ，最常见的是通过基本的2D 明视野显微镜剖析 ，该剖析涉及心脏功效盘算的误差。光片荧鲜明微镜是专门为斑马鱼胚胎研制的。这些显微镜可以实时跟踪心肌壁和红细胞的运动。因此 ，现在可以用这些显微镜制作4D跳动的斑马鱼心脏影戏。通过LSFM快速获取图像 ，使得将DPIV和盘算建模等先进手艺应用于斑马鱼研究成为可能。然而 ，由于斑马鱼心脏小尺寸和快速移动界线的成像和建模难题 ，现在大大都研究涉及二维心脏平面的血流动力学剖析�？⒕哂胁畋鹌矫嫱酵枷袷章奘虑樵淼娜PIV系统将有助于斑马鱼心脏在三维中的直接和快速可视化。超声生物显微镜和光学相关断层扫描系统已乐成应用于其他胚胎动物系统 ，以及成年斑马鱼。这些是胚胎斑马鱼成像的潜在很是有用的方法。由于体型很是小 ，现在的商业系统不适合斑马鱼胚胎。我们希望在不久的未来能开发出新的探针来成像胚胎斑马鱼。凭证CFD建模 ，未来的模子应基于流体-结构相互作用要领 ，将壁动力学和血流动力学团结起来。整合手艺来爆发斑马鱼的缺陷模子 ，将为研究者翻开新的视野。
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