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摘要：嗅觉损失（嗅觉损失）是 SARS-CoV-2 熏染的普遍症状。 嗅觉损失可能由非神经元细胞熏染和鼻上皮损伤驱动的几种机制来诠释 ，而不是嗅觉感受神经元 (OSN) 的直接熏染。我们发明病毒卵白足以引起硬骨鱼嗅觉器官（OO）的神经免疫反应。我们假设SARS-CoV-2刺突卵白足以引起嗅觉损伤和嗅觉功效障碍。成年斑马鱼模子显示鼻内注入的 SARS-CoV-2 S RBD 主要与嗅觉器官的非感受上皮细胞团结 ，并导致严重的嗅觉组织病理学 ，其特征是纤毛损失、出血和水肿。然而 ，在 SARS-CoV-2 S RBD 注入的鱼中没有发明对食物的行为偏好损失。成年斑马鱼嗅觉器官的单细胞RNA序列批注 ，支持细胞、内皮细胞和髓系细胞簇中嗅觉受体表达和炎症反应普遍缺失 ，同时Treg数目镌汰。腾博会官网效果批注 ，鼻内SARS-CoV-2 S RBD足以对斑马鱼嗅觉系统造成结构和功效损伤。这些发明可能对鼻内接种SARS-CoV-2疫苗具有指导意义。
要害词：SARS-COV-2 刺突卵白 斑马鱼 动物模子 嗅觉损伤 EOG 嗅觉受体表达
简介：气息严重影响动物的行为和生涯。SARS-CoV-2 熏染的一个标记是急性嗅觉损失或嗅觉损失。虽然大大都报告嗅觉损失的 COVID-19 患者在发病后 2 周最先嗅觉恢复 ，但一小部分（~5%）报告称一个月后一连保存嗅觉障碍。病毒引起的嗅觉损失并非 SARS-CoV-2 熏染所独吞的； 其他呼吸道病毒 ，如鼻病毒、流感、副流感和季节性冠状病毒 ，会导致人类嗅觉障碍。虽然 COVID-19 患者嗅觉损失简直切机制尚不清晰 ，但已经提出了一系列潜在的可能缘故原由。 首先 ，病毒引起的嗅觉损失可能是由于鼻腔的炎症性壅闭 ，COVID-19 患者的嗅上皮 (OE) 中的促炎细胞因子水平升高。在小鼠OE中 ，I型滋扰素的诱导导致嗅觉受体（OR）表达的普遍损失 ，这批注纵然在没有活跃病毒复制的情形下 ，炎症也可能导致嗅觉功效障碍。然而 ，大宗 COVID-19 患者报告嗅觉障碍与鼻腔肿胀无关 ，因此需要进一步研究。其次 ，支持细胞的 SARS-CoV-2 熏染可能会继发性损害嗅觉感受神经元 (OSN) ，从而损害化学气息信息向嗅球 (OB) 的传导。在小鼠和人类中 ，在OB的支持细胞（SCs）、嗅觉干细胞和血管周围细胞（周细胞）中检测到ace2表达 ，但在OSN中未检测到。别的 ，在人体活检中 ，在嗅觉器官 (OO) 的固有层和 SCs 中检测到病毒 RNA ，批注 OSNs 不经常被熏染。别的 ，用 SARS-CoV-2 熏染金黄地鼠会导致大部分 SC 熏染 ，但不会熏染 OSN ，然而OSN受损 ，纤毛的大宗缺失证实晰这一点。综上所述 ，SARS-CoV-2熏染SCs可能会改变整个OO的局部代谢和炎症状态 ，从而导致OSN受损和随后的嗅觉缺失。SARS-CoV-2 Spike (S) 卵白是同源三聚体 ，每个单体由一个 S1 亚基和一个 S2 亚基组成。S1 亚基包括一个 N 端结构域和受体团结结构域 (RBD)。 SARS-CoV-2 S RBD 与宿主细胞上的血管主要素转换酶 2 (ACE2) 团结 ，然后丝氨酸卵白酶（如 TMPRSS2）切割刺突卵白 S1/S2 位点 ，以增进病毒粒子与宿主细胞膜的融合。一旦 RBD 与 ACE2 团结 ，就会爆发复合物的内吞作用。 一旦进入细胞内 ，S 卵白可能会被降解 ，并且可能会从受熏染的细胞中释放出游离的 S 卵白片断。事实上 ，据推测 ，受熏染的细胞和病毒粒子会脱落游离的可溶性 S1 亚基 ，这些亚基可以团结 ACE2 并导致下游有害作用和炎症。虽然这一假设需要进一步的实验支持 ，但病毒衍生的卵白质 ，如来自冠状病毒和 HIV 的糖卵白 ，已被证实可在外周血细胞中诱导 IFN 反应。别的 ，已经纪录了对病毒卵白的神经炎症反应 ，纵然在没有自动熏染的情形下。例如 ，我们已经证实熏染性造血坏死病毒的糖卵白（G卵白）足以触发硬骨鱼的鼻神经免疫反应�；谡庀钛芯� ，我们假设SARS-CoV-2 S RBD卵白足以引起嗅觉病理学和功效障碍。斑马鱼的嗅觉系统在分子息争剖学上与人类有很洪流平的相似性斑马鱼OO由袒露在外部情形中的两个自力鼻孔组成 ，OSN直接检测情形水中的化学刺激。鼻孔由许多嗅觉板、指状结构组成 ，每一个都笼罩着非感受和感受神经上皮。感受区由基内情胞、中心神经元前体、成熟的OSN和支持细胞组成 ，类似于哺乳动物的OE。OSN轴突成束穿过基底层 ，在固有层形成嗅丝。在固有层中 ，除了OSN轴突束外 ，还发明成纤维细胞、胶质细胞和血管。斑马鱼 OO 已在差别的毒物和损伤模子中举行了普遍研究。斑马鱼 OO 和 OB 的再生能力批注嗅觉恢复的动力学约莫需要 2 周； 与在患有嗅觉障碍的 COVID-19 患者中视察到的相似的恢复时间表。与其他动物模子相比 ，斑马鱼具有滋生能力强、发育迅速、维护本钱低、身体小而透明等优点。在遗传学上 ，凌驾80%的疾病相关基因具有斑马鱼直系同源基因 ，并且在斑马鱼基因组中已判断出所有主要哺乳动物细胞因子组成员。
一些研究已经提出斑马鱼作为SARS-CoV-2的模子。实验通过浸泡熏染野生型斑马鱼仔鱼批注 SARS-CoV-2 缺乏熏染或复制。将SARS-CoV-2病毒微量注射到野生型斑马鱼幼体中 ，发明在膀胱中有适度复制 ，通过其他途径微量注射时没有复制。使用野生型斑马鱼（仔鱼或成鱼）来相识SARS-CoV-2熏染是有限的。成年硬骨鱼OO此前已被证实对来自病原体的卵白质有反应。在本研究中 ，我们研究了SARS-CoV-2 S RBD 卵白在 BSL-1 情形中对斑马鱼嗅觉系统的影响。本研究首次报告鼻内 (I.N.) 注入 SARS-CoV-2 S RBD 足以引起成年斑马鱼的嗅觉病变。损伤是短暂的 ，由于组织在 2 周内获得修复。 电心理学进一步批注成年斑马鱼在 I.N. 后对气息的功效反应受损 ，只管它们没有失去对食物气息的行为偏好。
脊椎动物ACE2分子的较量剖析：ACE2 卵白是人类细胞上 SARS-CoV-2 S RBD 的受体 ，并在哺乳动物 OE 的支持细胞中表达。脊椎动物血管主要素转换酶2（ACE2）分子的较量剖析批注 ，斑马鱼ACE2和人类ACE2之间的相似性划分为72%-73%和57.5%-58%。对SARS-CoV-2 S卵白团结区域的ACE2氨基酸举行检测发明斑马鱼ACE2在团结界面处的氨基酸具有适度的守旧性。综合起来 ，这些数据与之前的报道一致 ，批注硬骨鱼 ACE2 卵白不太可能与 SARS-CoV-2 S 团结。
SARS-CoV-2 S RBD 的鼻内注入导致成年斑马鱼的嗅觉损伤：嗅觉损失是人类熏染 SARS-CoV-2 的最早体现之一。我们之前已经证实 ，IHNV糖卵白足以诱导硬骨鱼的快速鼻免疫反应和神经元激活。因此 ，我们假设重组SARS-CoV-2 S RBD卵白可能足以损伤斑马鱼的OO。为了验证这一假设 ，我们将重组SARS-CoV-2 S RDB注入成年AB斑马鱼的鼻腔 ，并在3小时（h）、1天（d）、3天（d）、5天（d）和2周（w）后采样OO。阴性比照包括仅接受赋形剂 (PBS) 注入鼻腔的动物以及接受相同剂量 r-CK12a 的鱼。 我们还包括一个 Poly(I:C) 注入组作为 dsRNA 诱导的抗病毒作用的特殊比照。在检查的所有早期时间点 ，SARS-CoV-2 S RBD 足以对斑马鱼 OO 造成严重损害。在注入后3小时 ，早期组织损伤的特征就是固有层泛起水肿和内皮炎症。注入后1天视察到嗅板尖端和底部泛起出血。在 3 h 时在上皮中视察到水肿 ，以组织中的空腔为特征 ，但到 1 d、3 d 和 5 d 时 ，在整个固有层发明水肿。别的 ，通过丈量距中缝 50 μm 处固有层的宽度来量化水肿 ，并发明在 I.N注入 SARS-CoV-2 S RBD后 3 小时和 3 天固有层显著扩张。注入后1天、3天和5天 ，视察到硬骨鱼嗅觉上皮的上皮镶嵌结构缺失。注入后5天在SARS-CoV-2 S RBD注入的动物中视察到由于严重坏死导致的整个嗅板层丧失 ，而比照动物没有嗅板层丧失。在所有早期时间点 ，所有接受SARS-CoV-2 S RBD注入的动物都视察到嗅板纤毛显著缺失。接受 r-CK12a 或 Poly(I:C) 的斑马鱼没有视察到嗅觉损伤。评估 I.N. 后 OO 的恢复情形。 我们在注入后2周检查了组织切片。对斑马鱼嗅觉系统可塑性的研究批注 ，在 OO 化学消融 2 周后 ，结构和功效得以恢复。在I.N.SARS-CoV-2 S RBD后2周的OO与经赋形剂注入的OO相似。神经上皮镶嵌修复；没有水肿 ，纤毛看起来很康健。这些效果批注 ，SARS-CoV-2 S RBD足以在斑马鱼OO中造成严重但短暂的组织损伤 ，在缺乏活跃的SARS-CoV-2复制的情形下 ，可能爆发嗅觉损伤。
图1、鼻内注入SARS-CoV-2 S RDB卵白会对成年斑马鱼造成严重的组织学损伤 ，并在2周后恢复。
为了定位重组SARS-CoV-2 S RBD卵白与OO之间的相互作用 ，在SARS-CoV-2 S RBD重组卵白注入15分钟后 ，我们对在成熟纤毛OSN中内源性表达红色荧光卵白（RFP）的OMP:lynRFP动物举行了抗His抗体免疫荧光染色。SARS-CoV-2 S RBD卵白普遍漫衍于非感受上皮 ，抗-His阳性区域缺乏RFP信号就证实晰这一点。别的 ，野生型斑马鱼在接受SARS-CoV-2 S RBD注入15分钟后的非感受区域放大图显示 ，沿着板层的非感受上皮区域保存有限的点状抗His染色。SARS-CoV-2 S RBD注入15分钟的动物的同型比照染色和赋形剂注入动物上的抗-His染色在这些区域均未显示信号。为了评估斑马鱼同系物ace2是否在斑马鱼的嗅觉系统中表达 ，通过qPCR丈量比照成年斑马鱼的OO和OB上的转录水平。我们证实了斑马鱼OO中ace2的中度表达水平 ，而OB中ace2的表达水平很是低。因此 ，SARS-CoV-2 S RBD可能与斑马鱼OO中的Ace2相互作用 ，只管不可扫除配体-受体相互作用的其他机制。
鼻内注入SARS-CoV-2 S RBD改酿成年斑马鱼的固有层：凭证H&E剖析 ，注入SARS-CoV-2 S RBD后斑马鱼OO 3D固有层中显着保存大的纤维斑块。肺组织纤维化是 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 患者的标记 ，其特征是成纤维细胞一连保存以及胶原卵白和其他细胞外基质因素的太过沉积。为了确定在斑马鱼固有层中视察到的转变是否与肺纤维化中发明的转变相似 ，我们举行了Masson三色染色 ，将胶原蓝染。与比照组相比 ，SARS-CoV-2 S RBD动物在3小时或3天内蓝色染色的胶原卵白沉积没有增添。然而 ，在 3 d 时视察到大宗鲜红色的沉积物 ，批注保存于注入动物固有层中的纤维质料由角卵白组成 ，可能有助于组织愈合。细胞角卵白 8 (CTK8) 是斑马鱼再生历程中的表皮标记物。比照成年斑马鱼 OO 中的 CTK8 染色显示非感受上皮以及 SCs 和基内情胞中的阳性染色模式。I.N. Poly(I:C)注入没有改变 OO 中的 CTK8 染色模式。在I.N.SARS-CoV-2 S RBD后3小时 ，非感受上皮镶嵌结构被破损；祖细胞水平基内情胞通常由扁平形态变圆 ，柱状SCs不太显着。SARS-CoV-2 S RBD后3天 ，非感受上皮高度杂乱 ，固有层的一些细胞中泛起CTK8染色 ，与比照组或固有层CTK8阴性的3小时OO样本形成鲜明比照。
图 2. SARS-CoV-2 S RDB 卵白的鼻内注入导致成年斑马鱼 OO 爆发严重的细胞转变。
我们很好奇CTK8免疫反应模式的这种转变是否是由于固有层和OE受损后OO的细胞动力学改变所致。因此 ，我们使用抗PCNA抗体来评估处于细胞破碎合成阶段的细胞。用同型比照而非抗PCNA抗体染色的OO冰冻切片显示没有抗体反应。与赋形剂注入的OO相比 ，在I.N.SARS-CoV-2 S RBD后3小时和3天 ，PCNA反应阳性的细胞数目显著增添。与以往对斑马鱼OO的研究类似 ，大大都PCNA阳性细胞位于非感受上皮中 ，只管有些细胞位于板层的感受区。注射SARS-CoV-2 S RBD后3天的PCNA阳性细胞数目与注射病毒模拟物poly（I:C）后3天的PCNA阳性细胞数目差别 ，这与两个注入组之间视察到的组织学差别相呼应。别的 ，由于 OSN 纤毛的丧失 ，我们很好奇神经上皮内的细胞是否凋亡。用同种型比照而不是抗激活的 caspase-3 抗体染色的 OO 冷冻切片显示没有抗体反应性。我们发明 I.N 后3 小时和 3 天凋亡细胞显著增添。 SARS-CoV-2 S RBD 在 3 h 和 3 d 时主要位于非感受上皮细胞中 ，在 3 d 时一些细胞簇泛起在感受上皮细胞中。在本研究中 ，与之前在鳟鱼中的发明相比 ，单次注入病毒模拟物poly（I:C）不会导致显著的细胞凋亡 ，但三次注入poly（I:C）确实会导致细胞凋亡。
鼻内注入SARS-CoV-2 S RBD会导致嗅觉缺失但不会改酿成年斑马鱼的食物偏好：与预注入对食物气息的反应相比 ，成年斑马鱼I.N.给予 SARS-CoV-2 S RBD对食物提取物的嗅觉反应瞬间显着降低 ，嗅觉电图纪录 (EOG) 的振幅降低了 50%。袒露于SARS-CoV-2 S RBD后1分钟内 ，嗅觉反应降低 ，批注嗅觉功效爆发了瞬间转变。每5分钟纪录一次对食物气息的嗅觉反应4秒 ，一连1小时。在 5 分钟的距离期 ，用水冲洗 OO 以扫除多余的气息并阻止太过袒露导致 OSN 脱敏。经 SARS-CoV-2 S RBD 注入的鱼对食物提取物的嗅觉反应降低一连 1 小时。比照组动物对食物气息的反应在任何时间点都没有镌汰。这证实了SARS-CoV-2 S RBD注入个体对食物提取物的嗅觉反应降低并非由于太过袒露于食物气息导致OSN脱敏 ，而是与OO受损有关。为了进一步量化 I.N. SARS-CoV-2 S RBD引起的嗅觉降低水平 ，我们使用了斑马鱼中保存的两个自力的嗅觉室 ，将统一动物的一个鼻孔袒露于 SARS-CoV-2 S RBD 卵白 ，将统一动物的另一个鼻孔袒露于赋形剂 (PBS) 并期待 3 小时、1 天、3 天或 2 周 ，然后通过 EOG 丈量嗅觉。我们视察到3小时SARS-CoV-2 S RBD鼻孔对食物和胆汁的嗅觉反应划分比赋形剂注入的鼻孔镌汰49%和44% ，在注入后1天 ，食物和胆汁嗅觉反应的嗅觉功效划分镌汰60%和89%。接受SARS-CoV-2 S RBD注入的鼻孔中 ，一些个体在1天后对胆汁没有EOG反应。对食物提取物的嗅觉敏感性降低小于胆汁 ，这可能是由于与食物中发明的氨基酸相比 ，加入胆汁酸检测的 OSN 数目较少。SARS-CoV-2 S RBD注入2周后 ，鼻孔之间的EOG反应没有差别。与赋形剂注入的鼻孔相比 ，注入比照重组卵白（r-CK12a）后3h、1d、3d和2w对食物和胆汁的EOG反应没有显著差别。腾博会官网效果批注 ，EOG 视察到的 SARS-CoV-2 S RBD 诱导的嗅觉损失并非特定于 OSN 的一个子集 ，由于SARS-CoV-2 S RBD 注入的斑马鱼中食物提取物和胆汁嗅觉信号均受到抑制。
图 3. SARS-CoV-2 S RDB 卵白的鼻内注入导致成年斑马鱼嗅觉损失。
斑马鱼嗅觉器官的单细胞剖析：为了更好地相识SARS-CoV-2 S RBD诱导成年斑马鱼嗅觉功效障碍的机制 ，我们举行了单细胞RNA-Seq（scRNA-Seq）研究。鉴于腾博会官网组织学发明和 SARS-CoV-2 S RBD 与非感受上皮区域的团结 ，我们假设转录扰动由于间接机制而爆发在支持细胞和 OSN 中。在注入SARS-CoV-2 S RBD 3小时或3天后举行scRNA-Seq。我们共判断出8个神经细胞簇（NC）、5个SC簇、3个内皮细胞簇（EC）和7个白细胞簇（淋巴和髓细胞）。
鼻内注入SARS-CoV-2 S RBD可诱导成年斑马鱼嗅觉器官的炎症反应和普遍的嗅觉受体表达损失：鉴于从组织学和细胞动力学视察到的形态转变以及 EOG 对气息的反应改变 ，我们假设 SARS-CoV-2 S RBD 治疗导致 OSN 的转录组转变。斑马鱼 OO 的细胞景观受到 SARS-CoV-2 S RBD 注入和时间的影响。与比照组和3小时治疗组相比 ，在治疗后3天 ，表达omp的成熟纤毛OSN的比例显著降低 ，这在神经元细胞类型的比例中尤为显着。相比之下 ，表达细胞周期标记物（aubk、ecrg4和mki67）和神经元分解和可塑性标记物（neurod1、neurod4、gap43、sox11和sox4）的神经元祖细胞在治疗后3天扩增。有趣的是 ，与比照组相比 ，在从 COVID-19 和甲型流感患者死后人体实质网络的更多单核转录组中发明了许多这些可塑性相关的基因。别的 ，检测到属于淋巴细胞2簇的细胞比例显著下降 ，该簇在注入重组SARS-CoV-2 S RBD后3小时表达Treg细胞标记物（foxp3b）。在第 3 天 ，我们视察到第三个淋巴细胞簇 ，但在 3 小时未检测到该细胞簇。该分子在哺乳动物的Th1型免疫反应中具有免疫调理作用。这些效果批注 ，斑马鱼OO的神经元和免疫细胞亚群对SARS-CoV-2 S RBD有主要的细胞反应。
总之 ，腾博会官网研究批注 ，SARS-CoV-2 S1卵白的一个片断RBD可导致成年斑马鱼的嗅觉病理学和嗅觉损失。腾博会官网研究效果支持病毒衍生卵白如SARS-CoV-2 S RBD可能具有神经毒性作用的看法。本研究提出了与宿主熏染 SARS-CoV-2 后 S1 和 S1 衍生卵白片断的生化相互作用有关的主要问题。若是RBD或其他S1片断在体内释放 ，游离病毒卵白的保存可能会导致或加剧病毒病理心理损伤。进一步的研究可以为这一假说提供实验支持。
原文出自：Intranasal delivery of SARS-CoV-2 spike protein is sufficient to cause olfactory damage, inflammation and olfactory dysfunction in zebrafish - ScienceDirect
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