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恒久和短期接触碳纳米颗粒 (CNP) 会影响胎儿发育和随后的不良效果，包括早产、宫内生长受限、低出生体重、与成年期心血管、呼吸和神经系统相关的康健危害增添。CNPs 的不良发育效果是众所周知的，但其潜在机制仍未知。 本研究用50、100、200μg/mL的CNPs处置惩罚斑马鱼胚胎，视察其毒性作用。使用 RNA-seq 剖析要领，我们研究了 CNP（200 μg/mL）对受精后 4 到 96 小时（hpf）袒露的斑马鱼胚胎基因表达的影响。我们视察到CNPs处置惩罚的胚胎畸形增添，孵化镌汰。转录组剖析共检测到236个差别表达基因，这些基因与光转导、氨基酸代谢、类固醇和类固醇激素生物合成有关。通过实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 验证转录组效果。 腾博会官网研究效果批注，CNPs 袒露最有可能导致类固醇和激素生物合成途径中的差别基因转变，从而诱导发育毒性，例如斑马鱼胚胎的延迟孵化、畸形率增添和多种畸形表型。
要害词：碳纳米颗粒 斑马鱼胚胎 转录组剖析 发育毒性 畸形表型
简介：黑碳（BC）保存于细颗粒和超细颗粒的大气颗粒中，主要粒径小于1?m，主要粒径小于0.18?m。一些研究发明，情形空气中的纳米BC颗粒很容易进入人体，并迁徙到更深的循环系统中。例如，Maher等人在尸检大脑样本的额叶皮质中检测到了来自空气污染的燃烧衍生纳米颗粒。别的，在所有受试儿童的尿液中检测到BC，总平均值（SD）为98.2×105（29.8×105）粒/毫升。在所有筛查的胎盘中都发明了 BC，低袒露和高袒露女性的平均 (SD) 粒子计数划分为 0.95 × 104 (0.66 × 104) 和 2.09 × 104 (0.9 × 104) /mm3 粒子。胎盘BC负荷与孕妇在妊娠时代的家庭BC袒露呈正相关。为了研究恒久袒露于碳纳米颗粒 (CNP) 对生物体的影响，Wistar 大鼠被重复腹膜内注射 给药4 周。注射前，将纯粉末纳米粒子以 500 mg/L 的浓度悬浮在无菌盐水溶液中。 效果批注，纳米粒子在注射部位周围的腹腔内主要以聚整体形式保存，肝脏的肠系膜和浆膜也视察到了小的聚整体，批注纳米粒子可能已经转移到肝脏。另一项研究使用鸡胚模子，通过将浓度为 500 μg/mL 的实验溶液注射到卵白卵白中来研究六种差别类型 CNP 的毒性。孵育5、10、15和20天后视察概略病理学和存活率。 作育 20 天后，收罗血样并丈量器官重量。效果批注，CNPs能降低胚胎的相对存活率，并在循环中存活，无显着副作用，值得进一步研究。因此，公众越来越关注含BC的CNP的清静性，需要对这些纳米大气颗粒物举行周全的毒性评估。
胎儿发育是袒露相关易感性的一个要害窗口。 成年期疾病的病因可能源于胎儿，并可能归因于宫内情形袒露的倒运影响。例如，袒露于燃烧相关的大气颗粒物污染（包括BC）与早产和宫内生长受限有关。别的，围产期接触 BC 也会在成年后诱发一系列疾病。 斑马鱼胚胎是探索发育毒理学机制的最有希望的模子之一。为了研究氧化锆纳米颗粒（ZrO2 NPs）对胚胎发育的影响，斑马鱼胚胎在受精后24–96 hpf内注射0.5、1、2、3、4或5μg/mL的ZrO2 NPs。效果批注，0.5～1 μg/mL的浓度可引起胚胎急性发育毒性，并视察到胚胎殒命、孵化延迟和畸形。袒露于ZrO2NPs会导致轴向弯曲、尾部弯曲、脊髓弯曲、卵黄囊和心包水肿。另一项研究视察了 CuO NPs 对斑马鱼胚胎的发育毒性。 受精后 4 小时至 96 hpf的斑马鱼胚胎袒露于差别浓度的 CuO NPs (0.5, 1,1.5 mg/L)。效果批注，CuO NPs 不可进入斑马鱼胚胎组织，但可能导致殒命率增添、孵化延迟和心率下降。别的，CuO NP可导致头尾畸形、脊椎畸形、卵黄囊水肿、心包水肿和其他类型的异常。袒露于 30 μg/mL CNPs 60 天，已视察到成年斑马鱼心脏组织中吸收的碳颗粒的位置，并证实晰含有 BC 的 CNPs 对斑马鱼心脏的潜在慢性影响。然而，BC 和含 BC 的 CNP 袒露影响胚胎发育的机制仍不清晰。因此，该研究选择斑马鱼胚胎作为实验工具，购置CNPs作为实验室替换品，以替换真实天下中含有BC的CNPs。斑马鱼胚胎在24、48、72和96hpf的孵化率和畸形指数被以为是在袒露于CNPs后检测到的。 别的，对比照组和袒露于 200 μg/mL CNPs 的斑马鱼举行了转录组较量，以更好地相识差别表达基因 (DEGs) 和 CNPs 诱导胚胎发育毒性的潜在机制路径。
CNPs对斑马鱼胚胎的毒性作用：48hpf比照组的孵化率为19.17%，而50、100和200 μg/mL浓度组的孵化率划分为5.83%、5.00%和2.50%，显着低于比照组。72hpf比照组的孵化率为89.17%，而50、100和200μg/mL浓度组的孵化率划分为52.50%、48.33%和48.33%，也显著低于比照组。别的，50、100和200μg/mL（96hpf）的畸形率划分为39.02%、50.68%和77.14%。已发明畸形胚胎，包括眼发育不全、心包水肿、血液循环障碍、卵黄囊畸形、脊索弯曲、尾巴弯曲、黑素细胞镌汰、心跳减慢，畸形数目随着剂量和时间的增添而增添。在200μg/mL浓度组中，眼部发育不良、卵黄囊畸形和血液循环障碍等畸形的数目显著高于其他组。仅在最高浓度组视察到对触摸无反应的异常征象。
图1、差别浓度组斑马鱼的孵化率和畸形率。（a）差别浓度组的48hpf和72hpf孵化率。（b） 差别浓度组的96hpf畸形率。
图 2、 96 hpf 时袒露于 50,100,200?μg/mL CNPs 引起的表型转变。
图 3、96 hpf 袒露于 CNP 的斑马鱼胚胎差别类型畸形的数目。
CNPs对基因表达的影响：RNA-seq 数据显示，在 200?μg/mL CNP 和比照组中，从胚胎样本中获得的平均无污染读数划分为 21876005 和 22549680。两个样本的平均基数比 6?G 更显著。总的来说，这些效果批注数据质量可以知足进一步的剖析。对袒露于CNPs的正常斑马鱼胚胎举行RNA-seq和基因表达谱剖析批注，共有236个基因差别表达，其中102个基因显著镌汰，134个基因显著增添。然后，对所有爆发显著转变的DEG举行GO富集剖析和进一步的KEGG富集剖析。DEGs的显著富集有几个GO术语，包括“生长”、“节律历程”、“细胞外区域”、“抗氧化活性”和“解毒”。为了更好地研究 CNPs 对斑马鱼差别基因表达的调控，基于 KEGG 通路数据库，DEGs 在功效上被归类为典范的信号通路。凭证top值，“光转导”、“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”、“类固醇生物合成”、“类固醇激素生物合成”是主要的显著调理途径。KEGG富集网络图显示，CNPs破损了斑马鱼胚胎光转导途径中的基因表达，包括两个上调基因（enam、guca1e）和四个下调基因（guca1c、loc110437775、opn1mw2），以及7个氨基酸代谢途径中的差别表达基因，包括5个下调基因（ASN、abat、psat1、gcshb、pipox）和2个上调基因（gls2b、agxtb）。别的，类固醇生物合成和类固醇激素生物合成途径中有7个差别表达基因。 其中，上调基由于hsd17b7、cyp3a65、cyp51和sqlea，下调基由于cyp1a、sult5a1、ugt2b3。
图 4. 96hpf 袒露于 200?μg/mL 的 CNP 的转录组剖析。
通过 RT-qPCR 验证 DEG：选择富含类固醇生物合成和类固醇激素生物合成途径的DEGs，从RNA-Seq效果中选择7个基因（sult5a1、sqla、ugt2b3、hsd17b7、cyp1a、cyp3a65和cyp51）的表达，通过qRT-PCR检考试证 RNA-Seq 数据。如图 5 所示，关于上协调下调基因，qPCR 的效果与 RNA-seq 的效果很是吻合。
图5、类固醇生物合成和类固醇激素生物合成信号通路中要害基因的表达和验证。
讨论：差别浓度的 CNPs 可诱导显着的发育毒性。 与比照组相比，CNPs显着滋扰斑马鱼胚胎的正常发育，且孵化延迟和致畸作用呈时间和剂量依赖性。类似的研究批注，丁二烯烟灰 (BDS) 纳米颗� ？赡艿贾掳呗碛惴⒂拘�，包括心包水肿、卵黄囊肿胀、轴向畸形。在这项研究中，视察到卵黄囊畸形，这可能会影响营养代谢，从而影响胚胎发育。 在蛋黄发育历程中，胚胎可以使用蛋黄中积累的内源性营养物质。在鱼卵中，内源性脂质储备，主要是磷脂和三甘油，以卵黄球的形式保存。对卵黄囊的影响也可能是由于脂质合成和代谢的改变。卵黄囊的任何损伤都可能阻碍胚胎发育时代的营养供应，这可能是异常发育的缘故原由。效果批注，在CNPs诱导的斑马鱼胚胎发育毒性的许多异常表型中，48/72/96 hpf发明脊索弯曲呈剂量依赖性。脊索弯曲是本研究中视察到的最主要的表型转变之一，可能导致胚胎骨骼畸形。心脏发育是胚胎爆发的主要终点。 在腾博会官网研究中，我们发明斑马鱼胚胎有心包水肿和心脏血液循环障碍。2019年的一项研究批注，CNPs可以引起心肌组织显着的超微结构转变，并以剂量依赖性方法诱导炎症因子的表达，导致心内膜下炎症和细胞凋亡。别的，本研究视察到斑马鱼眼发育不全，可能影响斑马鱼的视觉发育。RNA-Seq 剖析批注，光转导、氨基酸代谢、类固醇和类固醇激素生物合成途径比其他途径显着富集了更多的 DEG。在实验中，CNPs溶液呈玄色，尤其是浓度越高，CNPs溶液的颜色越深，这批注袒露组和比照组的光线差别。光在斑马鱼的发育中起着主要作用，影响视网膜的总厚度和感光细胞层的厚度，从而影响视觉的生长。色素减退是斑马鱼在没有光照条件下发育时通常爆发的一种转变。其他研究强调，袒露于斑马鱼胚胎/幼虫中的污染物可能会改变与发育性眼病相关的晶体卵白基因的基因表达水平。别的，袒露于氯氰菊酯48小时后，斑马鱼幼虫的眼睛发育毒性可能会改变与视觉相关的基因，扰乱斑马鱼胚胎的光诱导途径。在本研究中，我们视察到斑马鱼的眼部发育不良和黑素细胞镌汰，以及光转导途径的异常表达，这批注应使用敲除模子动物来探索毒性效应与机制途径之间的关系。
类固醇和激素生物合成途径是斑马鱼胚胎发育、代谢和内渗透的主要途径。RNA-seq剖析和RT-qPCR数据强调，CNPs袒露诱导的斑马鱼胚胎毒性可能与甾体天生途径中要害酶的基因突变有关。胆固醇作为类固醇激素的前体分子。 激素爆发的限速办法是将胆固醇转运到线粒体内基质，在那里它转化为孕烯醇酮。转录组测序效果批注，sqlea是胆固醇代谢的要害基因之一。孕烯醇酮进入内质网举行进一步的酶促反应，爆发种种类固醇激素。类固醇激素对性器官和行为的组织和发育、免疫功效、生长和应激反应都很主要。细胞色素P450酶具有区域特异性，关于催化甾体天生途径中的甾体原特异性反应至关主要，腾博会官网研究还发明了细胞色素P450酶基因的要害差别，包括cyp1a、cyp51、cyp3a65和ugt2b3。研究批注，cyp11a1在具有卵黄合胞层、染色体间原基、染色体间腺的斑马鱼胚胎中表达。胚胎斑马鱼的芯片剖析和原位杂交显示，cyp51在眼脑和尾鳍的额叶表皮细胞中强烈表达，批注cyp51和其他异戊二烯合成酶可能在造血和血管发育中施展作用。大大都CYP在发育历程中的作用和调理是未知的，阻碍了对发育毒性机制的明确。别的，催乳素受体相关卵白/17β-羟基类固醇脱氢酶7型基因（hsd17b7）在胚胎发育和胎儿存活中起着要害作用。研究批注，敲除hsd17b7功效可能导致小鼠胚胎殒命、脑畸形和心脏缺陷。别的，胚胎发育中类固醇生物合成的途径尚未剖析。虽然类固醇激素在成年斑马鱼中的作用已经获得了很好的研究，但它们对早期胚胎发育的影响还远未清晰。进一步剖析类固醇和激素生物合成途径在斑马鱼胚胎发育中的毒性机制可能很主要。
总之，我们首次证实晰斑马鱼胚胎袒露于CNPs的发育毒性。RNA-Seq剖析和RT-qPCR数据批注，CNPs袒露主要影响光转导、氨基酸代谢、类固醇和类固醇激素生物合成途径的DEGs。这些数据可以提供进一步可能的研究要领，以更好地相识 CNP 在胚胎发育中的毒理学机制。
原文出自：The developmental toxicity and transcriptome analyses of zebrafish (Danio rerio) embryos exposed to carbon nanoparticles - ScienceDirect
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