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摘要：脑源性神谋划养因子 (BDNF) 在神经元生长和分解、神经元可塑性、学习和影象中起要害作用。 我们使用 CRISPR/Cas9 手艺构建了一个主要的 斑马鱼Bdnf 基因敲除突变系
，并对其举行了分子和行为表征。只管在形态学检查中没有发明显着的缺陷
，但与野生型同系胚胎相比
，66% 的编码基因和 37% 的 microRNA 在 bdnf-/- 中保存差别表达。我们深入研究了生物钟通路
，并证实了时钟（arntl1a、clock1a 和 clock2）和时钟控制（anaat2）基因的节律性表达的转变。通过行为测试验证了 Bdnf 对斑马鱼生物钟的调理作用
，突出了 bdnf-/- 仔鱼缺乏昼夜运动节律。通过药物治疗可拯救部分昼夜节律行为。 这里先容的 bdnf-/- 斑马鱼系是第一个有价值且稳固的脊椎动物模子
，用于研究 BDNF 相关的神经发育疾病。

要害词：鱼仔鱼：bdnf基因敲除导致昼夜节律失调神经行为  分子神经科学  发育神经科学 细胞神经科学

简介： 脑源性神谋划养因子（BDNF）是一种小的渗透性卵白质
，属于神谋划养因子家族。自觉现以来
，BDNF一直被以为在中枢神经系统发育历程中对调治离散神经元群的分解和存活至关主要。通过团结两类跨膜受体（泛神谋划养因子 p75 受体和原肌球卵白相关激酶 (Trk) 家族受体）施展作用
，对 TrkB 亚型具有较高的亲和力。与这些分子的相互作用导致主要信号通路的激活
，这些通路调理下游基因的表达
，这些基因加入调理特定神经元靶细胞的生长、维持和存活。BDNF除了在神经系统发育中起到公认的作用外
，还具有在学习和影象历程中增强突触可塑性的功效。大宗证据批注
，BDNF 在恒久增强中施展要害作用
，突触可塑性的一种形式被普遍以为是研究恒久影象形成的细胞模子。BDNF 还加入调理昼夜节律。 它在啮齿动物下丘脑的视交织上核 (SCN) 有节奏地表达
，BDNF 还加入调理昼夜节律。 它在啮齿动物下丘脑的视交织上核 (SCN) 有节奏地表达
，并在光夹带中起主要作用。迄今为止
，关于BDNF作用的大部分可用信息都来自于在小鼠举行的研究
，但整个情形尚未完全剖析。主要障碍是bdnf纯合子缺失的早期产后致死性。因此
，所有用果仅限于杂合子动物
，这些动物没有体现出显着的表型受损。

BDNF在脊椎动物中很是守旧
，哺乳动物和鱼类之间的序列同源性较高（>90%）。虽然Bdnf和其他神谋划养因子已经在斑马鱼中举行了研究
，但它们在鱼类品系的机制层面上的研究却很少。最近
，这种神谋划养素在斑马鱼的大脑再生、食欲和新陈代谢中施展了作用。与哺乳动物相比
，在斑马鱼中有可能爆发可行的敲除突变体。在这项研究中
，我们使用 CRISPR/Cas9 手艺爆发了一个具有稳固且可遗传的纯合 40 碱基对 (bp) 敲除的 bdnf-/- 斑马鱼系
，并剖析了突变体与比照的转录和行为表型。我们视察到Bdnf突变体在游泳运动中体现出显着的缺陷
，这与Bdnf在运动和学习等重大行为中的既定作用一致。差别表达剖析（RNA-seq 和 qPCR）展现了与昼夜节律系统有关的要害基因表达的改变。 别的
，在本研究中
，我们旨在研究 bdnf 突变仔鱼体内的一样平常和昼夜节律运动。虽然突变体仔鱼的光夹带没有受损
，但在一连的黑漆黑
，节律性强烈削弱
，批注Bdnf在昼夜节律运动中的作用。有趣的是
，我们还发明一些加入调理时钟基因表达的 miRNA 在突变体中表达差别。凭证腾博会官网研究效果
，我们建议将 bdnf-/- 斑马鱼作为一种理想的脊椎动物模子
，用于剖析 Bdnf 在重大行为（如运动、进食和学习）以及抑郁和焦虑相关疾病中的作用。

斑马鱼bdnf-CRISPR/Cas9基因敲除：为了研究Bdnf在斑马鱼神经系统发育历程中的作用
，我们构建了一个CRISPR/Cas9介导的敲除系
，位于影响所有五种ORF基因亚型的起始密码子下游Bdnf第2外显子缺失40 bp。使用T7内切酶I（T7EI）检测从微量注射胚胎中提取的基因组DNA
，评估针对所选区域的gRNA诱变的效率。F0突变鱼与野生型（wt）鱼杂交。 杂合种群 (bdnf+/-) 培育一代 (F2) 以镌汰嵌合体和意外的脱靶突变。使用T7EI剖析和Sanger测序
，我们验证了nova2基因中没有突变
，这是CRISPR设计工具展望的唯一脱靶基因。F3 代反应了 25% bdnf+/+、50% bdnf++/- 和 25% bdnf-/- 鱼的孟德尔比率。对每种情形下的胚胎池总卵白裂解物举行的Western印迹剖析证实
，Bdnf+/-鱼中的Bdnf卵白水平约为Bdnf+/+比照组的一半
，纯合Bdnf?/?中的Bdnf卵白水平险些消逝。虽然我们没有预推测完整突变体的卵白质裂解物中会有任何阳性信号
，但我们在卵白质印迹中视察到一条微弱的条带
，这可能是由于母体 Bdnf 或异源抗 BDNF 抗体与其他神谋划养因子的交织反应。

图 1. bdnf-/- 斑马鱼系的天生

因此
，我们得出结论是我们乐成地建设了稳固的、可遗传的bdnf-/- 斑马鱼系。主要的是
，在突变胚胎中未视察到发育历程中的形态异常和致死性。雄性和雌性突变鱼都能进入成年期
，并体现出正常的滋生乐成率。

bdnf 敲除仔鱼的行为：除了已知在神经元、存活和分解中的作用外
，BDNF还在突触可塑性的调理中施展作用。因此
，我们推测它的缺失可能会影响调理 bdnf 突变体运动运动的神经回路。 为了验证这一假设
，我们丈量了受精后 4 天 (dpf) 仔鱼对光刺激的反应。与bdnf+/+（n=32）比照仔鱼相比
，突变仔鱼体现出运动缺陷
，杂合子bdnf+/-（n=32）仔鱼的活性显著降低
，纯合子bdnf?/? n=32）仔鱼的强烈运动抑制。通过三个参数来丈量运动缺陷：光刺激后10分钟内的总行程、速率和旋转频率。与 bdnf+/+ 仔鱼所有三个丈量参数相比
，bdnf+/- 仔鱼的镌汰并不显著
，而 bdnf-/- 仔鱼影响严重。别的
，在测试时代斑马鱼在箱内路径的轨迹举行的剖析批注bdnf?/? 仔鱼体现出显着的趋向性
，
，即动物倾向于避开箱的中心并趋向其边沿或外围移动
，而 bdnf+/+ 和 bdnf+/- 仔鱼无显着边沿趋向。由于趋向性是动物中一个经由充分验证的焦虑指数
，该效果也证实了Bdnf在斑马鱼应激相关行为中的作用。为了证实视察到的表型与 Bdnf 的缺乏有关
，我们通过用 10 μM 的 7,8-二羟基黄酮水合物 (7,8-DHF)（一种合因素子）处置惩罚 22 hpf bdnf-/- 胚胎举行了药理学实验 通过激活其 TrkB 受体来模拟 Bdnf 的作用。对 7,8-DHF 处置惩罚的 bdnf-/- 突变仔鱼 (n = 32) 的行为测试批注
，与 bdnf-/- 仔鱼 (n = 89) 相比
，运动运动的恢复具有统计学意义。这些效果证实
，Bdnf缺乏会影响斑马鱼仔鱼的运动运动和趋向性。

图 2. bdnf+/- 和 bdnf-/- 斑马鱼仔鱼的行为

图 3. bdnf-/- 斑马鱼仔鱼的药理试验测试

使用 RNA-seq 对 bdnf-/- 系举行差别基因表达剖析：我们对 48 hpf bdnf-/- 突变体和 bdnf+/+ 胚胎举行了深度 RNA 测序 (RNA-seq)。每个样本平均爆发 2800 万个短配对最后片断
，其中约莫 89% 被明确定位到斑马鱼基因组。我们使用 DESeq2 要领在 48 hpf bdnf-/- 突变体和 bdnf+/+ 胚胎之间判断出 2614 个上调基因和 1653 个下调基因
，批注与 bdnf突变相关的显著转录差别。值得注重的是
，加着迷谋划养途径的要害基因的差别表达水平的上调
，例如Trk2a（主要Bdnf和Nt4/5受体）、Trk3a（Nt3受体）和p75（Ngf、Bdnf、Nt3、Nt4/5和Nt6/7的通用神谋划养因子受体）。这一方面尤其具有吸引力
，由于它可能批注
，在bdnf缺失的遗传配景下
，神经元存活途径（即Trk2a和Trk3a的上调）与殒命途径（即p75的上调）在发育历程中爆发了须要的再平衡。为了深入相识差别表达基因的功效
，我们对上协调下调基因举行了基因本体论 (GO) 富集剖析。我们确定了与bdnf通路相关的几个种别
，如神经系统发育和功效、光感受、游泳行为
，以及有趣的生物钟。这些效果证实了bdnf突变系诱导转录组水平上的生物学转变。

Bdnf 调理昼夜节律：为了验证转录组学剖析的效果
，我们研究了8 dpf 的bdnf+/+和bdnf?/?仔鱼在12:12明暗（LD）周期或恒定漆黑（DD）条件下时钟和时钟相关基因的表达模式。在突变仔鱼中
，ZT9处arntl1a表达水平的增添被显著抑制。在DD条件下
，正如预期的那样
，bdnf+/+仔鱼坚持了时钟控制基因表达的节律模式
，并显示出光诱导基因per2和cry1a mRNA的显著抑制。相反
， bdnf ?/?仔鱼
， clock1a和clock2的表达谱在24小时内泛起失常。加入褪黑激素合成和调理的时钟控制基因在鱼类昼夜节律计时系统中也施展着主要作用。aanat2是松果体中催化褪黑素合成的酶
，其转录水平在光照期最先时较低
，然后升高
，在夜间（ZT21）竣事时抵达峰值。

图4. 斑马鱼仔鱼生物钟基因的昼夜表达水平

图5、斑马鱼仔鱼生物钟控制基因的昼夜表达水平

讨论：在这项研究中
，我们研究了Bdnf在斑马鱼发育历程中的作用
，通过使用专门编辑目的基因的最具立异性的手艺CRISPR/Cas9系统爆发40 bp敲除。在确认 bdnf 外显子 2 中的选定突变导致 Bdnf 丧失后
，我们剖析了与 bdnf-/- 突变体相关的转录和行为表型
，展现了加入调理昼夜节律的要害基因的损伤。现在
，关于Bdnf在昼夜节律调理中的作用的数据很少。本事情中形貌的实验使验证转录组剖析的效果成为可能
，由于差别光刺激条件（即 LD 或 DD 周期）下的行为测试证实了昼夜节律的改变。22hpf的bdnf?/?仔鱼经7,8-DHF处置惩罚发明当举行运动剖析测试时
，拯救部分突变表型
，从而证实突变行为现实上是由于缺乏Bdnf卵白。在动物模子中举行的体内实验再现了人类疾病的特定特征
，为明确该疾病的发育起源提供了时机。在神经发育配景下
，斑马鱼代表了一种强盛的生物学工具
，用于研究与遗传畸变相关的特定机制。在动物模子中模拟突变怎样影响神经系统发育
，关于突出抑郁症和焦虑等神经疾病的潜在机制至关主要
，这些疾病与Bdnf缺乏或昼夜节律改变亲近相关。由于bdnf在脊椎动物中高度守旧
，推导出斑马鱼氨基酸序列与哺乳动物的同源基因91%相似
，我们假设在腾博会官网突变鱼类中视察到的分子和行为表型可能会举行临床转化。

以前的研究报道
，小鼠bdnf突变体体现出认真运动、平衡和姿势控制的前庭神经节神经元镌汰。在小鼠模子中
，剖析BDNF作用的一个主要障碍是纯合突变体在出生后的早期致死性
，通常爆发在出生后2天内；只有一小部分动物最多能活2-3周。到现在为止
，所有可用的效果都来自于对杂合子动物的研究
，这些杂合子动物已到杀青年状态
，并且看起来有生育能力。由于少量的BDNF可能能够施展其自身的功效
，因此完全敲除BDNF关于充分相识这种神谋划养素施展的许多生物学功效至关主要。构建的bdnf-/- 斑马鱼品系可以资助填补这一差别并提供新的看法。只管我们对其心理学仍然知之甚少
，但这里先容的斑马鱼突变系能够存活到成年期
，并且可能诠释来自旁系同源基因所施加的“代偿网络效应”的激活
，这些基因已被证实可以缓冲基因组编辑诱导的有害突变 。在 bdnf+/- 小鼠中
，BDNF 在 SCN 中的显著抑制表达和 DD 中光诱导的运动运动批注这种神谋划养因子在调理光夹带中起作用。在将外源性BDNF注入SCN改变对光脉冲的行为反应的大鼠试验中也获得了类似的效果。由于这一要害问题之前尚未研究过
，我们还研究了Bdnf在斑马鱼生物钟系统中的作用。

事实上
，在突变体中
，DD条件下的运动运动是失常的
，并且通过药物治疗部分恢复了节律行为
，证实晰该模子的有用性。别的
，DD 突变仔鱼中 mRNA 表达模式的差别批注 Bdnf 对 clock1a 和 clock2（昼夜节律反响回路的两个正元件）以及编码催化褪黑激素合成的酶 aanat2 的调理作用。鱼类生物钟的一个要点是松果体有节奏地合成和渗透褪黑素激素。褪黑激素在夜间爆发
，其爆发速率取决于 AANAT 的酶活性。夜间高褪黑激素水昭雪映了 AANAT 合成和活性的增添
，而白天褪黑激素爆发的终止反应了这种酶的卵白酶体降解。总体而言
，这些数据首次在 bdnf-/- 斑马鱼仔鱼中网络
，为将 Bdnf 在昼夜节律中的多效性提供了一个新框架。 然而
，需要进一步的实验来确定可以直接或间接将 Bdnf 毗连到分子生物钟网络的中心因素。靶向Bdnf-TrkB通路下游的特定Bdnf信号因素关于展现这一有趣分子的重着述用是须要的。

总之
，我们形貌了第一个可行的 bdnf-/- 脊椎动物模子
，该模子为神谋划养因子的分子和细胞机制提供了奇异的看法。我们证实斑马鱼幼体中的Bdnf对行为昼夜节律的爆发至关主要
，并能更好地举行人类神经发育和昼夜节律调理疾病临床转化。这项研究证实了 Bdnf 加入的众多途径
，并且构建的斑马鱼突变系可作为未来研究的奇异工具
，旨在相识 Bdnf 在差别生物历程中的作用
，如神经元发育和突触转达、视觉光感知、 再生和新陈代谢。

原文出自：Loss of circadian rhythmicity in bdnf knockout zebrafish larvae - ScienceDirect