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摘要：紫外线对人类既有害又有益 。本研究旨在探讨紫外线C（UVC）对生物体的毒性和清静性，以及响应的生物防御分子机制 。，为增添 UVC 照射剂量，使用高效深紫外线发光二极管（278 nm）照射处于早期发育阶段（受精后 5-6 小时）的斑马鱼胚胎，并评估包括存活率、孵化率、心率和畸形率在内的形态学表型 。与未照射的比照相比，所有袒露于 4.5 mJ/cm2 UVC 的斑马鱼胚胎都存活下来，并且在孵化和心率方面没有显著差别 。然而，袒露于7.5 mJ/cm2 UVC 的斑马鱼胚胎存活率显著下降 (37.5%) 和畸形率增添 (81.8%) 。因此，选择 4.5 mJ/cm2 作为斑马鱼胚胎内部生物防御系统抵御 UVC 辐射的极限剂量 。对辐照后 3 分钟和 3 天的胚胎（4.5 mJ/cm2）举行的转录组剖析（RNA 测序）展现了斑马鱼胚胎对辐照反应的分子机制 。胚胎通过激活p53信号通路迅速对UVC诱导的应激做出反应 。在恢复3天后，胚胎体现出信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路的激活 。据我们所知，这是第一项评估斑马鱼胚胎在 278 nm UVC 照射下的毒理学效应和生物防御分子机制的研究 。
简介：紫外线（UV）辐射由太阳自然发射，凭证波长规模可分为三种类型：315至400 nm的长波紫外线A（UVA）、280至315 nm的中波紫外线B（UVB）和100至280 nm的短波紫外线C（UVC） 。大气和臭氧层可以完全过滤UVC，只有UVA（太阳紫外线能量的90-99%）和部分UVB（太阳紫外线总能量的1-10%）抵达地球外貌 。紫外线辐射是威胁人类康健的一个显著危害因素 。太过袒露于紫外线会导致白内障、光老化、红斑、色素冷静和皮肤癌 。然而，适当剂量的紫外线辐射可能有益于人类康健，好比治疗新生儿黄疸和晚年佝偻病的紫外线疗法 。在三种类型的紫外线辐射中，UVC 是最有能量的，因此也是最危险的 。 短波紫外线灯 (254 nm) 常用于水产养殖或医疗设施中以灭活细菌和病毒，但它也会对人类造成重大的 DNA 损伤 。众所周知，UVC 对人体有害 。 最近，222nm远紫外线照射在微生物杀菌方面体现出极好的效果，被以为对哺乳动物皮肤是清静的 。另一项研究报告称，207 nm 的紫外光可有用杀死微生物，而不会危险袒露的人体组织 。在 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 大盛行时代，皮肤耐受的远紫外线 (< 240 nm) 因其对包括严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 在内的人类冠状病毒的高效灭活而备受关注 。别的，需要对其他UVC波长（240–280 nm）对活生物体的辐射效力、毒性和清静性举行系统评估 。斑马鱼作为动物模子的优点包括易于饲养、高滋生力、快速发育、发育早期的光学透明性、与人类的遗传息争剖高度相似性，以及易于基因操作 。斑马鱼胚胎已被普遍用作毒理学、情形污染危害研究和药物开发研究的模式生物 。别的，斑马鱼是皮肤病学领域的合适模子，由于它们在遗传学和皮肤发育方面与人类体现出显着的相似性 。Li等人指出，与小鼠相比，斑马鱼是一种更好的人体皮肤疾病模子生物 。因此，斑马鱼被普遍用于模拟人类皮肤疾病，如大疱性表皮松解症、牛皮癣和玄色素瘤 。在已往的几十年里，紫外线辐射引起的康健危害引起了人们的关注，人类作育细胞某人类皮肤中潜在的基因图谱也获得了研究 。然而，由于使用了差别的组织模子，关于紫外线诱导途径的详细信息很少 。因此，斑马鱼被以为是系统明确紫外线相关征象和基本机制的理想模子 。 为什么斑马鱼是研究紫外线辐射影响的合适模子的另一个缘故原由是斑马鱼和哺乳动物之间的光激活和 DNA 损伤修复途径是守旧的 。之前的研究已经评估了斑马鱼胚胎中UVA和UVB辐射的毒理学 。例如，UVA袒露（320 nm）会导致斑马鱼胚胎中白细胞IL-1β的诱导和炎症反应 。Chen等人报道，UVB辐射（312nm）导致斑马鱼胚胎中junbb基因表达提前，从而导致细胞损伤 。然而，与UVC灭活SARS-CoV-2的效率研究相比，关于UVC的毒性、清静性以及生物体对UVC辐射的反应的系统性报告很少 。相识生物体怎样�；ず托薷醋陨砻馐躑VC损伤的潜在分子机制，可能有助于未来更好地使用UVC辐射 。在这项研究中，我们研究了差别剂量的高效深紫外线发光二极管 (UVC-LED, 278 nm) 照射对斑马鱼胚胎早期原肠胚阶段的影响 。 丈量了包括存活率、孵化率、畸形率和心率在内的形态表型 。 别的，耐受 UVC 辐照的胚胎被用于转录组剖析，以展现避免 UVC 光损伤的潜在分子机制 。
差别剂量UVC辐射对斑马鱼形态的影响：早期原肠胚阶段（5-6 hpf）的康健胚胎袒露于增添剂量的 UVC 。 由于照射距离恒定为 50 cm，照射时间逐渐增添 。照射后，袒露10 分钟或更长时间（≥ 15 mJ/cm2）的胚胎在第二天体现出 100% 的殒命率，因此无法获得响应的形态学数据 。在72 hpf下视察胚胎形态，并照射0.5、1、2、3和5分钟，划分相当于0.75、1.5、3、4.5和7.5 mJ/cm2的UVC剂量，如图1所示 。在 4.5 mJ/cm2 照射下胚胎的存活率为 100%，而在 7.5 mJ/cm2 剂量下视察到存活率快速下降（37.5%） 。比照组显示出最高的孵化率（96.7±3.3%），而在7.5 mJ/cm2袒露下72 hpf时视察到最低值（6.7±2.5%） 。比照组和袒露≤4.5 mJ/cm2 组的孵化率之间没有显著差别 。 与比照组相比，所有袒露组的心率均无显著差别 。 只管用 4.5 和 7.5 mJ/cm2 UVC 照射的胚胎显示心率下降，但没有统计学意义 。与比照组相比，在 1.5 mJ/cm2 或更少的 UVC 剂量照射的胚胎中未视察到畸形 。在 3、4.5 和 7.5 mJ/cm2 的 UVC 下的畸形率划分为 2.5%、12.5% 和 81.8% 。辐照后获得的典范图像如图 1E 所示 。袒露于4.5 mJ/cm2 的主要畸形是尾巴略微弯曲 。 袒露于 7.5 mJ/cm2 的斑马鱼胚胎中视察到更严重的发育畸形，如心包水肿、脊柱弯曲、卵黄囊水肿、尾巴畸形和生长缓慢 。
图 1. 72 hpf 时斑马鱼胚胎的形态丈量 。 斑马鱼早期原肠胚阶段（5-6 hpf）的胚胎袒露于差别剂量的 UVC（0、0.75、1.5、3、4.5 和 7.5 mJ/cm2） 。（A） 照射后斑马鱼胚胎的存活率、孵化率、心率和畸形率 。（E） 比照组和UVC照射胚胎的代表性图像 。
UVC辐射诱导生物防御系统的分子机制：只管视察到了稍微的畸形，但所有接受 4.5 mJ/cm2 UVC 照射的斑马鱼胚胎都存活了下来，批注这种辐照强度可能时胚胎内部生物防御系统抵御 UVC 辐射的极限 。因此，我们在随后的剖析中使用该辐射强度来展现这种生物防御的分子机制 。在 4.5 mJ/cm2 的 UVC 照射后，在 3 mpi 和 3 dpi 网络胚胎举行 RNA-seq 剖析，，划分作为对UVC照射的快速反应和晚期反应的丈量 。图2显示了在3 mpi和3 dpi下UVC辐照胚胎的转录组图谱 。
图 2. UVC 照射和比照胚胎的转录组图谱 。
对UVC辐射的快速反应：在 22874 个测序的斑马鱼基因中，选择参数设置为 FDR < 0.05 和绝对倍数转变≥ 1.5 的差别表达基因（DEGs），效果未发明任何基因 。选择参数设置为p < 0.05，绝对倍数转变≥ 1.5， 共判断出96个DEG，包括40个上调基因和56个下调基因 。通太过别输入上协调下调的DEG获得的生物历程（BP_ALL）种别如图3A所示 。GO 剖析是使用免费工具 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 6.8 举行的 。表达上调基因与细胞历程（GO:0008037，细胞识别；GO:0045216，细胞-细胞毗连组织；GO:0034330，细胞毗连组织；GO:1903530，细胞渗透调理；GO:0044763，单体细胞历程）和定位（GO:0051179，定位；GO:0044765，单体转运；GO:0051046，渗透调理）有关 。几个下调基因与细胞殒命（GO:0043066，凋亡历程的负调控；GO:0043069，程序性细胞殒命的负调控；GO:0060548，细胞殒命的负调控）和发育历程（GO:0072359，循环系统发育；GO:0072358，心血管系统发育）有关 。
图 3、 斑马鱼胚胎对 UVC 照射 (3 mpi) 的快速反应与相同发育阶段比照胚胎的 DEG 生物信息学剖析 。
生物信息学剖析显示，对UVC辐射反应最快的三种生物转化是“应激反应”，其次是“防御反应”和“免疫反应” 。别的，还研究了UVC辐射调理的生物途径，前三个受调理的途径是“p53的转录调理”、“Nectin/NECL信号途径”和“BLIMP-1的转录调理” 。IPA软件展望的最高羁系网络如图3B所示，它与“疾病和功效”有关，如“听觉疾病、神经疾病、器官损伤和异常” 。与GO剖析效果一致，通过通路剖析确定了一个下调的“B淋巴细胞分解”网络，以及一个上调的“细胞-细胞接触”网络，该网络对UVC辐射反应迅速 。
我们进一步举行了 qPCR 以验证快速响应 UVC 照射的顶级调理生物通路，即 p53 信号通路 。 KeyMolnet 软件展望的 p53 的盘算机分子网络的细节如图 4A 所示 。该网络中的15个要害基因被选择用于qPCR 。紫外线照射后，p53上游的基因，即ATM丝氨酸/苏氨酸激酶显著上调（2.75倍；p?<?0.05），并且p53的表达在UVC照射的胚胎中显著上调（与比照组相比）（1.3倍；p?<?0.01) 。别的，polo 样激酶 4（plk4）、聚合酶kappa（polk）和 BCL2 团结组分 3（bbc3） 显著上调 。与比照组相比，在 UVC 照射组中发明细胞周期卵白依赖性激酶 1（cdk1）显著下调 。
图4、p53通路加入斑马鱼胚胎对UVC辐射（3mpi）的快速反应的分子机制 。
紫外线照射后的迟发反应：在 3 dpi 斑马鱼胚胎中，在 24,507 个测序基因中，参数 FDR < 0.05 和绝对倍数转变≥ 1.5仅筛选出 9 个 DEG 。然而，中选择参数设置为p?<?0.05和绝对倍数转变≥?1.5共判断出192个DEG，包括89个上调基因和103个下调基因 。通太过别输入上协调下调的DEG获得的生物历程种别如图5A所示 。关于上调基因，与生物调理（GO:0010817，激素水平调理；GO:0042592，稳态历程）、细胞代谢历程（GO:0006721，萜类代谢历程；GO:0034754，细胞激素代谢 历程）和对刺激的反应（GO:0009581，检测外部刺激；GO:0009582，检测非生物刺激）有关 。下调的 DEG 与细胞反应（GO:0022411，细胞因素剖析；GO:0044763，单生物细胞历程；GO:1900543，嘌呤核苷酸代谢历程的负调理；GO:0045980，核苷酸代谢历程的负调理； GO：0051716，细胞对刺激的反应）和对刺激的反应（GO：0009611，对创伤的反应；GO：0071496，细胞对外部刺激的反应；GO：0042060，伤口愈合；GO：0031668，细胞对细胞外刺激的反应；GO :0043401，类固醇激素介导的信号通路）有关 。
图 5. 斑马鱼胚胎对 UVC 照射 (3 dpi) 的晚期反应与比照胚胎相同发育阶段之间的 DEG 的生物信息学剖析 。
在紫外线照射3天后，对UVC爆发反应的前三种生物转化是“转录的正调理，DNA模板化”，其次是“细胞群体增殖的调理”和“细胞殒命” 。按 p 值排列的前三个调理途径是“STAT 转录调控”，其次是“AP-1 转录调控”和“NFκB 转录调控” 。与“疾病和功效”相关的是“皮肤病和状态、器官形态、器官损伤和异常”功效 。别的，作为对 UVC 照射的晚期反应，“类视黄醇的代谢”和“淋巴样细胞的扩张”被上调，“伤口愈合”被下调 。加入信号转导和转录激活的种子基因1a和stat3在UVC照射下显著上调 。与比照组相比，上游和下游基因的表达，包括atm、CCAAT/增强子团结卵白（C/EBP）、δ（cebpd）、BCL2凋亡调理器δ、MCL1凋亡调理器，BCL2家族成员b（mcl1b）、birc5a、血管内皮生长因子Ab、MYC原癌基因、bHLH转录因子a（myca），细胞周期卵白D2（ccnd2a）在紫外线照射的胚胎中也显著上调 。
图6、斑马鱼胚胎对UVC辐射（3 dpi）的后期反应中，基于qPCR验证编码STAT通路中心产品的基因的表达 。
结论：由于 UVC 具有杀菌效果和低皮肤渗透性，预计 UVC 将用于消毒，特殊是用于根除 SARS-CoV-2 。在这项研究中，我们首次确定了UVC辐射在斑马鱼胚胎中的毒理学剂量及其转录组图谱 。斑马鱼胚胎在恢复三天后通过连忙激活p53和STAT信号通路来应对应激 。我们举行了进一步的哺乳动物研究，以验证我们在斑马鱼胚胎中的效果 。由于差别的UVC波长可能具有差别的效率，因此需要进一步研究 。
原文出自：Transcriptome analysis of molecular response to UVC irradiation in zebrafish embryos - ScienceDirect
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