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前言
在生物医学研究中 ，精准定位想要研究的目的基因或细胞是至关主要的。为了实现这一目的 ，报告基因工具鼠成为了不可或缺的研究工具。然而 ，面临种类云云繁多的报告基因工具鼠 ，“科研汪”们早已眼花缭乱 ，选择难题症都犯了...别怕 ，小编今天就来为您答疑解惑啦！希望能帮您找到合适的“小帮手” ，顺遂开启科研之路！
什么是报告基因工具鼠？
报告基因工具鼠 ，顾名思义就是携带报告基因（reporter gene）的小鼠模子 ，它是使用基因工程手艺手段 ，将报告基因整合到小鼠的基因组中构建而成。当报告基因表达时 ，我们可以借助实验仪器视察到其在组织或细胞水平的表达情形 ，从而实现在体内举行基因表达监测、细胞标记和谱系示踪等研究。
报告基因工具鼠在许多研究领域中获得了普遍的应用。在发育生物学研究中 ，研究职员可以使用报告基因工具鼠来视察特定基因在胚胎发育历程中的表达模式 ，从而展现胚胎发育的机制。在神经科学领域 ，报告基因工具鼠可以资助科学家研究神经元的发育和毗连 ，展现大脑功效和神经系统疾病的机制。在免疫学研究中 ，报告基因工具鼠可以用来研究免疫细胞的分解和活化历程 ，探索免疫应答的调控机制。
![图1. 报告基因工具鼠的部分应用场景[1].png](https://videos.modelorg.com/default/20231116/951f22f2db5efc055d1444a8a4942dd1.png!original "图1. 报告基因工具鼠的部分应用场景[1].png")
图1. 报告基因工具鼠的部分应用场景[1]
体内研究常用的报告基因有哪些？
报告基因是那些能编码某种易于检测卵白质或酶的基因 ，通过它的表达产品便捷、可靠、迅速的来标定目的基因的表达调控。体内研究常用的报告基因包括β-半乳糖苷酶、荧光卵白、荧光素酶等。
β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ，β-gal）由大肠埃希菌LacZ基因编码 ，是一种由四个四聚体组成的酶 ，每个四聚体的分子量为465kDa ，可将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色物质：5-溴-4-靛蓝。β-ga1常用于整体胚胎或组织切片的基因表达研究 ，由于使用β-gal举行胚胎的全身染色 ，可以充分相识某一基因在体内的表达谱全貌。
![图2. 使用lacZ检测Lgr5基因的表达情形[6].png](https://videos.modelorg.com/default/20231116/1fe9a2bf9ea1ebbe1aee69447e11b894.png!original "图2. 使用lacZ检测Lgr5基因的表达情形[6].png")
图2. 使用lacZ检测Lgr5基因的表达情形[6]
荧光卵白
荧光卵白家族（fluorescent protein family）是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发明的相对分子质量为(2～3)×104的同源卵白 ，包括绿色、红色、黄色和青色荧光卵白等 ，其中绿色荧光卵白(green fluorescent protein ，GFP)是应用最多的荧光卵白。
荧光卵白的发光原理在于其发色基团经一定波长的光（引发光）照射后被激活 ，并将能量以光能形式释放 ，这时我们就能在荧鲜明微镜下看到日思夜想的荧光色啦！荧光卵白常用于研究目的基因表达 ，卵白质运输以及种种细胞内动态的生物化学信号通路等。
![图3. 使用荧光卵白研究心脏发育或再生气制[7].png](https://videos.modelorg.com/default/20231116/f964593197079ffd39be3233af4f4003.png!original "图3. 使用荧光卵白研究心脏发育或再生气制[7].png")
图3. 使用荧光卵白研究心脏发育或再生气制[7]
荧光素酶
荧光素酶（luciferase）是生物体内催化差别底物(如荧光素、腔肠素等)发射出荧光或催化脂肪醛氧化发光的一类酶的总称 ，其中最具代表性的是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase ，Fluc）和海肾荧光素酶（renilla luciferase ，Rluc）。
萤光素酶可以催化自身底物氧化 ，在氧化历程中 ，一部分能量以光子形式被释放 ，从而发出生物荧光。只有活细胞内才会爆发发光征象 ，且光的强度与标记细胞的数目成正比。因此 ，荧光素酶自觉光的活体成像手艺已被普遍应用于生命科学、医学研究及药物开发等领域。
图4. 活体成像示踪Il1a细胞因子的表达。
差别类型报告基因具有各自的优弱点（见表1）。在现实运用中 ，须团结研究的目的、信号检测的时间性与空间性、首选的检测要领、组织与细胞的种别等选择适合的报告基因系统。
表1.体内研究常用报告基因的优弱点
怎样将报告基因整合到小鼠基因组中？
一样平常而言 ，将外源基因引入小鼠基因组的要领有两种：转基因和基因敲入。
1.转基因
(1) 随机转基因
将含有报告基因的外源DNA片断克隆至PiggyBac（PB）转座子质粒中 ，与转座酶一起注射到小鼠受精卵中。在转座酶作用下 ，外源DNA片断将会被整合到基因组上的TTAA位点处 ，从而获得表达报告基因的小鼠。
图5. PB转座子系统
虽然使用PB转座子系统将外源基因敲入在转座酶识别位点 ，可以提高转基因的表达阳性率 ，但依然阻止不了随机转基因随机整合的弱点。岂非就没有一种既能明确而准确地插入外源基因又能包管表达的要领吗？谜底是有的 ，那就是小编接下来要先容的定点转基因。
(2) 定点转基因
定点转基因的要害就在于“定点” ，Rosa26位点是现在最为常用的定点整合位点之一 ，将携带报告基因的DNA序列插入到小鼠的Rosa26位点上 ，可以包管报告基因在小鼠体内稳固表达。（除了Rosa26以外 ，尚有其他的清静位点可以选择 ，详见往期推文：读懂Safe Harbor——玩转基因过表达）
在组成型表达的基础上 ，我们还可以借助重组酶系统构建条件性表达报告基因的小鼠模子。以Cre/loxP系统为例 ，首先在启动子和报告基因之间插入转录终止盒（lox-stop-lox）构建Flox鼠 ，同时构建特异性Cre鼠（由特定启动子驱动 ，可在特定细胞或组织表达Cre重组酶）。将上述两种小鼠交配后 ，子代中可以获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠 ，在表达Cre重组酶的细胞或组织中 ，终止盒被Cre重组酶切除 ，因此仅在这些细胞或组织中才会表达报告基因。
![图6. 条件性表达报告基因小鼠的构建示意图[8].png](https://videos.modelorg.com/default/20231116/f2faeda0e05665a7703807ccc73827a0.png!original "图6. 条件性表达报告基因小鼠的构建示意图[8].png")
图6. 条件性表达报告基因小鼠的构建示意图[8]
2.基因敲入
与转基因差别 ，基因敲入是在小鼠内源基因的特定位点插入报告基因 ，可以更好地研究该基因的功效和调控机制。想要将外源报告基因敲入小鼠的内源基因 ，有以下三种方法：
图7. 基因敲入方法构建报告基因工具鼠战略图。
融合表达将报告基因敲入到小鼠内源基因的5'端或3'端 ，与内源基因融合表达。共表达共表达的构建方法是将报告基因通过2A（自剪切多肽）或IRES（内部核糖体进入位点序列）元件敲入到小鼠内源基因的3'端。取代表达取代表达的构建方法则是用报告基因取代小鼠自己的基因 ，使敲除和敲入同时爆发。
想必各人在选用共表达时 ，还会纠结IRES和2A元件要怎么选择？往期小编已经为各人详细解说过怎样选择毗连元件（详见往期推文：毗连元件丨2A和IRES怎么去选择？）�；谕谕莆� ，小编对IRES和2A元件的优弱点举行了简要总结 ，供各人参考~
1
IRES
优点：IRES上下游的两个卵白可以同时表达 ，并且翻译出的两个卵白是完全自力的。
弱点：IRES的序列较长（约600bp） ，其应用常受到载体容量的限制。别的 ，IRES前后两个卵白无法实现等量表达。通常情形下 ，下游卵白的表达量仅为上游卵白的10%~50%。
2
2A
优点：2A肽长度小且剪切效率极高 ，能够实现多卵白的等量表达。
弱点：上游卵白会多出20余个氨基酸的多肽尾巴 ，下游卵白会在N端多出一个脯氨酸。这种特殊增添的2A肽结构可能会对目的卵白的功效造成一定的影响。
![图8. 毗连元件IRES和2A的作用原理[9].png](https://videos.modelorg.com/default/20231116/38abb6e13f36ea2e4cced59534fe146d.png!original "图8. 毗连元件IRES和2A的作用原理[9].png")
图8. 毗连元件IRES和2A的作用原理[9]
由于IRES和2A肽都有着各自的优弱点 ，建议参考目的卵白的相关文献报道 ，或遵照履历举行构建。
Reference：
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