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1987年Brian Sauer博士报道了Cre-loxP重组系统可用在细胞中操作特定位点的特异性重组，由于该系统具有操作简朴、重组率高的优点，现在已成为体内外遗传操作的常用工具。现在使用Cre-lox系统，我们可以在特定细胞、组织或整个生物体，甚至在特准时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功效的研究和人类疾病动物模子的建设都有重大意义。 1.什么是Cre-lox系统？ 从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分： Cre重组酶 环化重组酶（Cre, cyclization recombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之一，能催化两个DNA识别位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶泉源于P1噬菌体，由 343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。除Cre以外，此类重组酶尚有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。 Lox位点 Cre重组酶识别的回文DNA位点，也叫loxP (locus of X-over P1) 位点，长34bp，其特征结构为 ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。双方反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中心的8个碱基为重组爆发位置，这也决议了loxP的偏向。N体现可变碱基，差别的碱基选择可形成差别的 Lox位点，除了野生型loxP，常见的尚有 Lox2272，Lox511，Lox5171等。 图1 . loxP位点及其突变体位点（图片来自Ref.1） 在统一个 DNA 分子上，凭证Lox位点的位置与偏向，可能会爆发3种差别的重组事务： （1）切除：当两个Lox位点在统一染色体上且偏向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列。 （2）反转：当两个Lox位点位于统一染色体上且偏向相反时，两个Lox位点之间的序列爆发序列反转，即倒置。 （3）易位：若是两个Lox位点位于差别的染色体上且偏向相同，将导致2条染色体上DNA片断的交流。 图2. Cre的重组机制。A）loxP位点的基本结构。红色箭头指示loxP位点的偏向。B）Cre-loxP介导的易位重组。C）左图示Cre介导两同向loxP位点间的切除重组。右图示Cre介导两反向loxP位点间的反转重组。（图片来自Ref.2） 2.体内Cre-lox系统的基础应用 Cre-lox系统通常包括两种小鼠：一是Cre工具鼠，该小鼠中的Cre重组酶由特定启动子驱动，可在特定细胞或组织表达Cre重组酶；二是Flox小鼠，即在小鼠靶基因序列两侧带有Lox位点。将上述两种小鼠杂交繁育，子代中可以获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠，即基因条件性敲除或过表达小鼠。 基因条件性表达所需要的Flox小鼠，一样平常在靶基因与启动子之间有一个“终止盒”（lox-stop-lox）。这些Flox小鼠与细胞类型特异性表达Cre的转基因小鼠交配后获得的子代小鼠中，在每个表达Cre重组酶的细胞中，终止盒被Cre切除，因此仅在这些细胞中表达所需的转基因。 图3. 条件性基因表达小鼠原理示意图（图片来自Ref.3） 基因条件性敲除的Flox小鼠，一样平常在需要切除的DNA片断两侧带有同偏向的两个Lox位点（lox-GENE-lox）。与细胞类型特异性Cre小鼠交配后，Cre 重组酶会识别Lox位点，导致靶基因被敲除。 图4. 条件性基因敲除小鼠原理示意图（图片来自Ref.3） 3. 更精准的诱导型Cre-lox系统 为了能够更准确地举行遗传功效研究，时间特异性的Cre-lox（也叫诱导型Cre-lox）被开发出来，可用于研究生物体发育历程特定阶段的基因功效，或用来举行谱系示踪等。常用诱导型Cre-lox系统有： 也叫他莫昔芬（Tam）诱导的Cre系统，将Cre与雌激素受体ER融合，可通过他莫昔芬（Tam）诱导Cre的重组活性。在没有他莫昔芬的情形下，CreER融合卵白与热休克卵白90（HSP90）相互作用并保存于细胞质中（图5.1）。给予他莫昔芬药物处置惩罚会破损HSP90与CreER的相互作用（图5.2）。ER与Tam的相互作用诱导Cre的核易位（图5.3）。在细胞核中，CreER识别loxP位点（图5.4）并使组织X中的基因Y失活（图5.5）。CreERT2在体内对药物诱导的敏感性更高，因此一样平常优选使用CreERT2。 图5. 他莫昔芬（Tam）诱导的Cre系统。（图5-7来自Ref.4） 四环素诱导系统，也叫强力霉素（Dox，四环素衍生物）诱导的Cre系统。该系统有两种模式：Tet-on和Tet-off，划分是Dox依赖性Cre的激活和Dox依赖性Cre的失活。Tet系统包括以下元件：反向四环素控制反式激活因子（rtTA）；四环素控制反式激活因子（tTA）；四环素响应元件（TRE），通常是19个核苷酸的四环素使用子（tetO）序列的7个重复，调理Cre基因的表达。Dox通常在小鼠的饲料或饮水中举行给药。 Cre;Tet-on系统：在Tet-on系统中，表达普遍保存的或组织特异性的启动子驱动的rtTA。在没有Dox的情形下，失活的rtTA无法与认真调控Cre基因的TRE序列团结，则Cre不表达。在Dox给药之后，Dox团结并激活rtTA。激活的rtTA与TRE序列团结并诱导Cre表达。 图6. Dox诱导的Cre;Tet-on系统。Dox给药才华翻开Cre表达 Cre;Tet-off系统：另一方面，在Tet-off系统中，在没有Dox的情形下，激活的tTA能够团结Cre前的TRE序列并诱导Cre表达。而在Dox给药后，与Dox相互作用的tTA被灭活。灭活的rTA不再与TRE团结，因此Cre表达受到抑制。 图7. Dox诱导的Cre;Tet-off系统。Dox给药后关闭Cre表达 4.南模生物Cre工具鼠库 南模生物可提供凌驾300多种自主产权Cre工具鼠，笼罩全身种种型的细胞组织，知足科研职员多样化的需求。同时，我们还在对Cre工具鼠举行周全的验证，现在已经完成了100多种Cre工具鼠的验证事情。 为了利便各人更快的找到自己想要的Cre工具鼠，我们还特殊定制了Find Cre搜索系统，该系统现已在官网上线，免费使用。Find Cre整个界面以小鼠组织、器官和系统为主线，可分为肺、肝、胃肠道、乳腺、胰腺、感受器官、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统、骨骼肌系统以及其他组织器官。选择自己感兴趣的组织器官，就可以审查该组织下可用的Cre工具鼠。 部分Cre品系验证数据如下： 1 Myh6-Cre Myh6特异性靶向小鼠心肌细胞，验证数据证实Myh6-Cre鼠是可以用于心脏特异性基因编辑的工具鼠。 图8. 荧光检测tdTomato在Myh6-Cre; Rosa26 tdTomato 小鼠胚胎中的表达，效果批注在E13.5和E14.5天小鼠心肌细胞均有tdTomato表达。 2 Alb-CreERT2 Alb-CreERT2小鼠是研究肝脏基因功效与疾病的主要小鼠品系，验证数据证实Alb-CreERT2小鼠可以成为实现肝脏时间特异性敲除或表达的工具鼠。 图9. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织X-gal染色。未使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞未被染色；使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞乐成着色。 图10. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织免疫荧光检测。Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠被他莫昔芬诱导后，LacZ（红色）表达。 图11. Alb-CreERT2小鼠血生化检测。效果显示Alb-CreERT2小鼠与野生型小鼠相比肝功效正常 3 Pvalb-Cre Pvalb-Cre在中心神经元中表达iCre重组酶，而不滋扰内源性Pvalb表达。这些小鼠可能对研究神经元分解有用。 图12. 荧光检测Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠大脑皮层中心神经元tdTomato的表达。 图13. 荧光检测Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠海马中心神经元tdTomato的表达。 效果显示：双阳性小鼠海马中心神经元有tdTomato的表达，表达类型切合预期。 4、Ucp1-CreERT2 Ucp1-CreERT2在棕色脂肪中表达CreERT2重组酶，验证数据证实Ucp1-CreERT2小鼠是可以用于棕色脂肪特异性基因编辑的工具鼠。 图14. 荧光检测 Ucp1-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/- 小鼠棕色脂肪和白色脂肪中 tdTomato 的表达。Ucp1-CreERT2 小鼠与 R26-tdTomato 小鼠举行交配，取棕色脂肪组织和白色脂肪组织举行荧鲜明微镜照相。实验效果显示 Ucp1-CreERT2 小鼠经 Tamoxifen 诱导后可以在棕色脂肪中表达。 5 Tyr-CreERT2 Tyr-CreERT2特异性靶向玄色素细胞，验证数据证实Tyr-CreERT2鼠是可以用于玄色素细胞特异性基因编辑的工具鼠。 图15. 荧光检测 Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/- 小鼠尾部表皮基底层的表达情形。 （A） R26-tdTomato+/-小鼠使用他莫昔芬诱导，表皮基底层的黑素细胞无红色荧光信号。 (B) Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射玉米油，表皮基底层的黑素细胞无红色荧光信号。 （C） Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射他莫昔芬，表皮基底层的黑素细胞泛起红色荧光信号。 图16. Tdtomato表达位置图；结论：Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/- 小鼠他莫昔芬诱导后表达在尾部皮肤基底层（白色虚线所示)的玄色素细胞（白色箭头所指）。 References 1. Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA. Ahigh-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics ofthe loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics.2006;7:73. Published 2006 Apr 4. doi:10.1186/1471-2164-7-73 2. Tronche F, Casanova E, Turiault M, Sahly I, Kellendonk C. When reversegenetics meets physiology: the use of site-specific recombinases in mice. FEBSLett. 2002;529(1):116‐121. doi:10.1016/s0014-5793(02)03266-0 3. Magnuson M , Osipovich A . Pancreas-Specific Cre Driver Lines and Considerations for Their Prudent Use[J]. Cell Metabolism, 2013, 18(1):9-20. 4. Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147 5. Song AJ, Palmiter RD. Detecting and Avoiding Problems When Using theCre-lox System. Trends Genet. 2018;34(5):333‐340.doi:10.1016/j.tig.2017.12.008 6. Duffield JS, Humphreys BD. 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2.1基因条件性表达
2.2 基因条件性敲除
3.1 CreER系统
3.2 Cre;Tet系统
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