编者：资源增量是实验动物科技生长的焦点使命，是实验动物对生命科学研究提供支持和效劳的基础和包管 。自上世纪80 年月以来，我国老一辈实验动物科学家苦心孤诣，在实验动物资源研发事情中取得的多项开立异效果 。
1988 年《实验动物治理条例》宣布实验，在实验动物事情规范化、法制化治理，包管实验动物和动物实验的质量，推动我国科技生长和民生包管等方面施展了主要作用 。特殊是在实验动物资源标准化、新品种/品系开发和动物模子创造方面，取得了令人瞩目的效果 。
为此，借“科技资讯”之窗，陆续推出我国实验动物专家在此领域所作的事情及取得的应用效果 。
实验用果蝇的标准化
倪健泉
清华大学医学院基础医学系
黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是100 多年前由Thomas Hunt Morgan 引入，作为模式生物举行科学研究的(Morgan, 1910) 。以后，随着遗传学要领的生长，果蝇引领了许多生物学新发明(Bellen et al., 2010) 。
现在，果蝇已经被普遍用于各个生物学领域，包括人类疾病和治疗要领的研究(Pandey and Nichols, 2011) 。
一、果蝇的主要生物学特征
1、基本生物学特征
果蝇成虫身长约2-2.5mm，雌性约重1.4mg，雄性约重0.8mg(Ong et al., 2015) 。在10℃-30℃温度区间果蝇可以生涯，温度越高，其生命周期越短(贺争鸣等, 2016.5) 。25℃作育条件下，果蝇生命周期（从胚胎发育到成虫）约10 天，其中胚胎、幼虫、蛹划分履历约1d、5d、4d(张鹏飞，毛玉蕊，杨绕华，孟琳琳，王进忠，魏艳敏, 2010) 。羽化后24 小时内果蝇即可交配，交配后雌果蝇天天可产卵达100 枚 。条件相宜、营养富足的情形下，果蝇寿命可达2-3 个月 。
2、果蝇的饲养和遗传学操作
凭证一样平常需要，果蝇可饲养于作育管或作育瓶中，底部安排玉米面、白糖、琼脂、抗生素等制备的作育基(王霞，乔欢欢，潘丽霞，任兴杰，孙锦，徐荣刚，刘鲁萍，贺争鸣，倪建泉, 2016) 。由于现在尚无有用的冷冻并苏醒成虫或幼虫的要领，因此天下上各大果蝇资源中心以及1800 多个果蝇实验室的种质资源生涯都接纳一连将成虫转移到新鲜作育基的要领 。实验室种质生涯可将果蝇饲养于18℃、60%湿度、12h/12h 交替光照的作育箱或房间，则其生命周期可达20 天左右，可一个月传代一次 。实验用果蝇饲养于18℃/25℃/29℃、60%湿度、12h/12h 交替光照的作育箱或房间，可使用差别温度实现差别实验目的（例如控制Gal4 表达量、控制Gal80ts 表达等） 。实验完成后，将放弃果蝇连同作育管或作育瓶放入-20℃冰箱冷冻住宿，包管果蝇所有殒命后，可作为通俗实验垃圾处置惩罚 。
举行遗传学操作时，古板要领是使用乙醚或乙醚与乙醇混淆物将果蝇麻醉后再举行，可是保存麻醉效果欠好、昏厥时间短、苏醒率低、对人体清静性差等问题 。现在大部分果蝇实验室接纳高压二氧化碳气体，经由减压阀处置惩罚后，通过麻醉枪和通气麻醉平板举行果蝇麻醉处置惩罚 。同时配套使用壁式加湿系统对二氧化碳举行预加湿，阻止操作历程中静电的影响 。该要领操作简朴，对果蝇无危险，且去除二氧化碳效果蝇苏醒迅速 。
3、果蝇基因组及染色体
果蝇是最好的遗传学研究工具之一 。一方面，果蝇基因组仅由四条染色体组成，遗传学操作简朴；并且果蝇基因组已经所有举行了测序和注释(Adams et al., 2000)，遗传配景清晰 。另一方面，果蝇拥有成熟、强盛的遗传学工详细系和品系资源，好比Gal4/UAS 系统、嵌合体手艺、近年来生长起来的基因组编辑和基因激活手艺，以及转基因滋扰品系资源库等，这是其他模式生物瞠乎其后的 。果蝇基因组编码14000 多个基因，其中95％的基因集中在X、Ⅱ和Ⅲ号染色体上(Emameh et al., 2015; Ong et al., 2015) 。这些基因与人类高度同源：50%以上的果蝇基因与人类同源，而75%以上的人类致病基因能在果蝇中找到同源物(Emameh et al.,2015; Sun et al., 2013) 。果蝇基因不但与人类基因序列守旧，功效上也具有很是高的相似性 。好比，加入基因表达和代谢调理的许多果蝇卵白质与人类对应物具有亲近的相似性 。别的，基因组剖析显示，果蝇中许多主要生化途径的生物合成网络与人类具有优异的对应关系(Ong et al., 2015) 。一百多年以来，使用果蝇举行生物医学研究做出了许多开创性的发明，例如干细胞微情形的看法最初就是在果蝇中提出的 。
二、实验用果蝇的要求
实验用果蝇一样平常需从国际公认的果蝇资源中心订购，如美国的Bloomington Drosophila Stock Center、日本的NIG、以及我国的清华大学果蝇中心，以包管基因型准确、遗传配景清晰、无微生物（细菌、霉菌、螨虫等）污染 。引入果蝇后，需对果蝇的表型举行确认，须要时可团结PCR、测序等方法进一步确认 。别的，将果蝇饲养于合适温度和湿度条件，包管其长势优异 。使用前，需要经由正规的隔离检查，包管无污染后方可放入实验室正式使用 。我国现在尚无针对实验用果蝇的手艺规范和明确划定，相关划定参照国家磨练检疫总局宣布和实验的《实验动物引种手艺规程》和《实验动物质�？刂埔蟆返任募� 。
三、实验用果蝇的应用研究
果蝇饲养容易、生命周期短，与其他短世代模子生物相比，却拥有更多的组织和细胞类型，以及富厚的、利便视察的表型和个体行为，因此为生命发育、成体康健、个体行为甚至进化等科学问题的探索提供理想的质料 。别的，百余年来积累的遗传学要领和资源为众多生物历程的研究提供了重大的便当 。使用果蝇举行的研究使我们在遗传学、细胞和发育生物学、神经生物学和行为学、分子生物学、进化学和生齿遗传学，以及其他领域取得了长足的前进(Hales et al., 2015) 。
使用模式生物举行生命科学研究的最终目的是效劳人类，资助预防和治疗人类重大疾病 。果蝇不但在基础研究领域至关主要，加深了我们关于众多生物历程中信号通路和分子机制的明确，并且在生物医学领域也为人类疾病的干预战略提供了主要的参考依据 。使用果蝇，研究职员建设了许多人类重大疾病模子，并用于探讨发病机理和治疗步伐 。例如，随着晚年生齿比例增添，全天下神经退行性疾病发病率逐年增添，给家庭和社会带来重大的肩负 。针对此问题，通过过表达人源显性可遗传疾病基因，建设了一系列神经退行性疾病的果蝇模子，包括阿尔兹海默症、帕金森综合征和亨廷顿舞蹈症 。这些疾病模子不但能够在组织和细胞水平上模拟人类的主要病理特征，还能通过幼虫和成虫的嗅觉学习、求偶、攻击和昼夜节律等行为从系统水平模拟人类神经退行性疾病的功效退化(Fernandez-Funez et al., 2015; Rincon-Limas et al., 2012) 。使用这些模子举行的研究，不但加深了人们关于疾病爆发生长历程的明确(Bodai et al., 2012; Campesan et al., 2011; Fernandez-Funezet al., 2015; Varga et al., 2014)，并且为探索疾病的治疗要领做出了重大的孝顺(Jansen et al., 2014;McGurk et al., 2015) 。
除了神经退行性疾病，在果蝇中建设模子并举行深入研究的人类疾病尚有免疫类疾病如哮喘、病原菌熏染疾病、金属中毒等(Calap-Quintana et al., 2017; Lestradet et al., 2014; Roeder et al., 2012)，代谢类疾病如肥胖及糖尿病、高糖饮食引发的心血管疾病等(Na et al., 2013; Teleman et al., 2012)，肿瘤如眼睛肿瘤、肠道肿瘤、卵巢肿瘤等(Bennett et al., 2015; Eliazer et al., 2011; Kirilly and Xie, 2007;Markstein et al., 2014; Richardson and Portela, 2018; Song and Lu, 2011; Sonoshita and Cagan, 2017;Yang et al., 2017)，以及朽迈、皮肤病等其他疾病研究(Bohnekamp et al., 2015; Brandt and Vilcinskas,2013) 。果蝇疾病模子不但可以在细胞和分子水平上很好地模拟人类发病机制，并且利于举行行为学视察和统计学剖析，其强盛的遗传学工具和品系资源更是为展现加入疾病的基因、信号通路、开发疾病治疗要领并应用到人类提供了极大的便当 。
四、实验用果蝇种群的建设与意义
近二十年来基因组学的生长一方面使人们获得了各物种全基因组序列，另一方面临于这些琐屑化的基因序列及其功效的熟悉息争读却远远缺乏 。作为研究最深入的多细胞生物和可靠的人类疾病模子，果蝇中表型明确的基因也仅仅占其基因组编码基因的约15%(Perkins et al., 2015) 。因此，大宗功效未知的基因和信号通路及其相互之间的作用关系仍需我们去探索 。
百余年来，果蝇在各生物医学领域的研究耐久不衰，除了其自身生物学特征外，最突出的优势即是一百年来果蝇研究积累的强盛的遗传学工具及品系资源 。例如，转基因RNAi 手艺的泛起使得我们可以及其便外地实现体内单个基因的表达调控 。为了越发便外地实现全基因组任何一个基因的表达调控和研究，果蝇全基因组水平的转基因RNAi 品系也应运而生，它们保存于奥地利的VDRC（http://stockcenter.vdrc.at/control/main）、日本的NIG（http://www.shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/index.jsp）、美国的BDSC（https://bdsc.indiana.edu/index.html）和中国的THFC（http://fly.redbux.cn/） 。这些品系涵盖了绝大部分果蝇基因，能够知足大部分研究职员需要 。以BDSC 为例，她拥有11000 多个基因的转基因RNAi 品系，笼罩了71%的果蝇编码基因(Perkins et al., 2015) 。在RNAi 品系的手艺原理方面，VDRC 和NIG 主要是使用前两代果蝇转基因RNAi 手艺构建的长链RNA 滋扰品系，BDSC 主要是使用第三代转基因RNAi 手艺构建的短链发卡RNA 滋扰品系 。清华果蝇中心（THFC）在原有8000 余株从TRiP 引进的品系外，又使用自主研发的新一代转基因滋扰手艺构建了3000 余株与人类高度同源基因及重大疾病基因的新转基因滋扰品系（Qiao Huanhuan etal., Nature Communications, accepted） 。与原有前三代RNAi 手艺构建的品系相比，这些新品系降低了与Gal4 杂交前的本底表达，提高了RANi 诱导后的基因敲低效率，并且实现了一次性敲低多个基因，因此尤其适合那些高表达、高拷贝的基因以及卵白质复合体的研究 。
近几年来，基于CRISPR/Cas9 系统的基因组编辑手艺及基因转录激活手艺有了长足的前进，使得果蝇基因表达调控方法越发多元化，为基因功效的研究提供了新的选择 。其中，基于CRISPR/Cas9 的基因编辑手艺可以实现高效的基因突变、插入和同源重组(Ren et al., 2013; Ren et al., 2014a; Ren et al., 2014b) 。清华大学果蝇中心与哈佛医学院相助研发的CRISPR/dCas9 介导的VPR 及系列flySAM 系统，可实现高效的基因原位激活 。随着果蝇遗传学新手艺的一直更新，配套的全基因组果蝇品系资源也成为新的迫切需求 。现实上，将Gal4/UAS 系统与CRISPR/Cas9 手艺团结，可以实现组织特异性的基因敲除或基因激活，并且其特异性纯粹地由sgRNA 决议，因此适用于高通量、全基因组的基因增强品系的构建(Ewen-Campen et al., 2017; Jia et al.,2018; 徐荣刚，王霞，王芳，孙锦，毛德才，乔欢欢，贾豫，朱芮葆，彭娉，刘鲁萍，倪建泉, 2018) 。
现在，哈佛医学院TRiP 中心正在陆续构建笼罩全基因组的基因突变和基因激活的sgRNA 品系，通过与阻止特异性Gal4 杂交，即可在子女果蝇中实现高效的基因突变或激活（https://fgr.hms.harvard.edu/trip-crispr-toolbox-fly-stocks） 。不久的未来，研究职员将可以通过BDSC 果蝇中心轻松盘问和订购所需sgRNA 转基因果蝇品系，实现目的基因的敲除或激活 。这些果蝇品系资源将与转基因滋扰品系团结使用，为果蝇研究提供主要的手艺资源，使各个领域的研究抵达事半功倍的效果 。
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