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目的基因过表达，是研究基因功效的主要要领之一。其中，怎样确保目的基因准确无误的表达是很是要害的一步。由于目的基因表达过量或者在不适当的时间表达都会影响到细胞状态或者机体的生长发育，进而影响实验效果。四环素(Tetracycline, Tet)调控基因表达系统便可以做到对基因表达的精准调控，今天小编便来先容这一神奇的基因开关。
四环素调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性使用子为基础而建设的。在细菌系统中，正常情形下，tetR将与tetO团结，抑制下游抗性基因的转录。当保存四环素或者四环素类似物如强力霉素时，tetR将与四环素团结，不再和tetO团结，造成下游抗性基因表达，细菌从而获得耐药性[1]。
图1 TetR和tetO在四环素耐药菌中的作用原理[1]
注：在没有四环素的情形下，TetR（紫色实心圆）以高亲和力与两个四环素使用子tetO1和tetO2 团结。这导致四环素外排转运卵白 TetA 的抑制。若是保存四环素时（玄色三角形），四环素与 Mg2+形成复合物（红色三角形）。该复合物与 TetR 团结，这导致TetR 与tetO疏散，TetA得以表达。
由此可见，四环素诱导基因表达系统的要害元件是四环素反应元件（TRE）和四环素阻遏卵白（TetR）。经由多年生长，这一系统也经由了多次优化，现在常用的TRE是由7个长度为19个氨基酸的四环素抗性使用子(TetO)组成，TRE及下游CMV启动子配合组成了四环素依赖性启动子（Ptet）。而对TetR的刷新，使得多种Tet调控系统逐渐生长起来，应用最为普遍的即是抑制型系统Tet-off和激活型系统Tet-on。
Gossen 和Bujard最初构建的系统即是Tet-off系统，即在四环素保存的情形，目的基因表达水平降低或者不表达。为了抵达这一目的，人们对大肠杆菌TetR举行了刷新，将疱疹病毒的 VP16 卵白的转录激活区域融合到TetR上，从而合成了反式激活卵白tTA，改变了TetR阻遏卵白的属性。在缺乏四环素时，tTA 将和TRE团结，VP16会使Ptet活化从而使基因表达增进目的基因表达，而在四环素保存时，tTA则与四环素团结，抑制目的基因表达[2]。
1995年，Gossen等发明了tetR加入四环素诱导的抑制反应的要害的4个氨基酸残基，这些氨基酸残基突变后可爆发反向的反应，即在四环素保存的条件下，目的基因能够表达卵白，而缺失四环素时，目的基因无法表达。新的反式激活卵白被称为rtTA，由rTetR与VP16融合而成[2]。
图3 Tet-on系统原理
经由多年的生长，人们对Tet-on系统的启动子和活化因子举行了一连的优化，使目的基因在没有四环素的情形下体现出更高的稳固性和更低的配景活性，在有四环素诱导情形下有更高的表达水平。其中，TRE3G和rtTA2 S -M2 变体体现出对四环素的高敏感性，成为现在普遍应用的四环素诱导系统的元件[3][4]。
图4 Tet抗性使用子、Tet-Off和Tet-On系统原理[3]
四环素诱导系统主要通过pTRE和tTA/rtTA两部分相互配合完成基因表达调控的功效。因此，使用四环素诱导系统在小鼠体内实现对目的基因表达的调控，原则上需要建设两种小鼠。
首先，建设pTRE小鼠，需将目的基因插入到四环素依赖性启动子下游，使目的基因的表达受四环素的控制。其次，需要建设tTA或者rtTA小鼠，该小鼠中的tTA/rtTA激活因子由特定启动子驱动，可在特定细胞或者组织或者全身表达tTA或者rtTA。
这两种小鼠繁育后，可获得子代小鼠中既带有pTRE及目的基因又带有tTA/rtTA的小鼠，即可实现通过四环素的有无来调控基因的表达。
Tet-off小鼠模子是通过tTA小鼠同pTRE小鼠交配获得。主要可应用于调控目的基因过表达的水平。例如，Giles等通过构建α-MHC-tTA; pTRE-cMyBP-C小鼠，举行了回复实验（Rescueexperiments），即将α-MHC-tTA鼠、pTRE-cMyBP-C鼠同cMyBP-C 敲除鼠交配，使用四环素基因调控系统在cMyBP-C 敲除小鼠中恢复cMyBP-C的表达，进而验证了cMyBP-C缺陷造成的心肌肥大的表型是可逆的。在这一系统中，通过注射四环素，还可以瞬时降低cMyBP-C的表达� ？杉�，Tet-Off实现可以对基因的功效的周全的研究[5]。
图5 Tet-off小鼠模子
Tet-On小鼠模子是通过rtTA小鼠同pTRE小鼠交配获得。主要应用于诱导目的基因过表达。例如，Song等通过构建Alb-rtTA小鼠，再注射pTRE-uPA腺病毒，制备肝脏损伤模子。Alb是肝脏特异表达的基因，uPA则是肝毒性物质，在注射四环素后，rtTA在Alb启动子的作用下，将在肝脏中同pTRE团结，进而过表达下游基因uPA，造成肝脏损伤[6]。
图6 Tet-on小鼠模子
现在，除四环素诱导系统以外，科学家们还开发了多种条件性基因调控系统，如Cre-loxp系统、Flp-frt系统、Dre-rox系统等，而四环素诱导基因表达系统仍具有自己的奇异优势。
首先Tet-On系统在没有诱导时目的基因的表达水平较量低，诱导时表达水平增高，最高诱导倍数可达10000倍。
其次原核泉源的TetR与TetO的团结特异性高，哺乳动物细胞中没有类似的DNA靶向序列，以是Tet系统调控特异性高，并且宿主基因不受到影响，适合于体内外的种种基因表达的调控。
同时，Tet系统的诱导药物为Tet或Dox，Tet作为一种抗生素已被人们应用了很长时间，是对人体较为清静的一种药物，并且在Tet系统中低剂量的Tet就可调理基因的表达，以是不会对动物或细胞爆发强毒性。
最后一点是，四环素系统具有可逆性，在去除诱导剂后可使系统关闭，也可重复加入诱导剂，多次启动诱导反应。
南模生物深耕基因编辑领域，在四环素诱导小鼠模子构建上有着成熟的手艺和富厚的履历，为您的基因功效研究之路保驾护航。已有和部分在研的四环素诱导动物模子信息见下表：
Reference:
[1]2013.igem.org/Team:Bielefeld-Germany/Biosafety/Biosafety_System_M
[2]www.addgene.org/collections/tetracycline
[3] Das AT, Tenenbaum L, Berkhout B. Tet-OnSystems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther.2016;16(3):156-67.
[4] Loew R,Heinz N, Hampf M, Bujard H, Gossen M. Improved Tet-responsive promoters withminimized background expression. BMC Biotechnol. 2010 Nov 24;10:81.
[5] Giles J,Patel JR, Miller A, Iverson E, Fitzsimons D, Moss RL. Recovery of leftventricular function following in vivo reexpression of cardiac myosin bindingprotein C. J Gen Physiol. 2019 Jan 7;151(1):77-89.
[6] Song X, GuoY, Duo S, Che J, Wu C, Ochiya T, Ding M, Deng H. A mouse model of inducibleliver injury caused by tet-on regulated urokinase for studies of hepatocytetransplantation. Am J Pathol. 2009 Nov;175(5):1975-83.
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